大便脱落细胞端粒酶活性与结直肠癌的早期诊断的临床应用前景
【关键词】 大便脱落细胞 端粒酶活性 结直肠癌 早期诊断
端粒酶(telomerase)是一种逆转录酶,它以自身RNA为模板,逆转录合成端粒DNA,可以避免因DNA复制时端粒缩短所致的细胞衰亡,使细胞获得无限增殖的能力。大多数恶性肿瘤中可检测到端粒酶的活性,而正常体细胞不表达或微弱表达端粒酶活性,可知端粒酶激活是肿瘤形成的重要机制之一[1]。端粒酶的活性与结直肠癌的发生、关系密切，在结直肠癌的早期诊断、预后判断中有希望成为一个重要指标。从大便脱落细胞中检测端粒酶活性作为结直肠癌的一种无创的早期诊断方法，对结直肠癌的普查有着广阔的前景。本文就大便脱落细胞中端粒酶的活性表达对结直肠癌的早期诊断的临床应用前景做一综述。
1 端粒酶与结直肠癌
1.1 端粒酶的结构与功能 端粒酶(telomerase)是一种由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白复合物,为非常特殊的逆转录酶。由三部分组成:端粒酶 RNA(hTR)模板、端粒酶相关蛋白(TEP)和端粒酶逆转录酶(hTERT)。人类端粒酶RNA成分于1995 年被克隆成功,其模板区序列为5′?CUAACCCUAAC?3′,此模板区与人的端粒DNA序列互补。以端粒3′末端为引物,在端粒酶逆转录酶催化下,通过模板的滚动,而特异合成端粒DNA。人类端粒酶相关蛋白被认为是端粒酶活性的调节亚单位,可作为支架募集、组织 hTR、hTERT、端粒及其他调节因子。人类 hTERT是端粒酶的催化亚基,利用端粒酶自身的RNA模板催化DNA端粒的合成。端粒酶活性主要由 hTERT 表达水平的高低决定[2]。并知端粒酶是以自身的内源性RNA为模板,合成端粒序列并添加到染色体末端部分,以维持端粒长度的恒定,使细胞无限增殖，从而维持细胞的寿命[3]。
1.2 端粒酶的活性与肿瘤的发生及其机制 1989年,Morin在人类宫颈癌细胞中首次发现活化的端粒酶。1994年,Counter等发现端粒酶活性仅存在于源自腹水转移的卵巢癌中,而在正常卵巢上皮组织中的端粒酶缺乏活性,从而逐步意识到端粒酶在肿瘤发生过程中的重要作用。同年,Kim[4]等采用基于PCR高灵敏度的端粒重复序列扩增法(TRAP)对来自人体18种不同组织的100个永生化细胞株和12种恶性肿瘤的101个针吸活检标本进行端粒酶活性检测,阳性率分别为 98%和 99%;而同时检测的 22个正常细胞株和50个正常组织标本全部为阴性。可见,癌细胞往往反常地出现端粒酶活化现象,以发挥合成端粒的功能,从而获得“永生性”(immortality)。且证明：细胞分裂较快的组织,端粒酶的活性就高;而细胞分裂较慢的组织,端粒酶的活性就低。研究显示:端粒酶的活化与细胞癌变密切相关,其机制涉及细胞凋亡(apoptosis)和细胞永生化[5]。正常人体内存在着抑制细胞无限增殖的复杂机制:一是细胞周期性控制;二是随着每次细胞分裂而发生端粒进行性缩短所引起的细胞凋亡或程序性死亡(procedural death)。基于端粒在细胞寿命控制中可能的作用,Harley等提出了“端粒假说”[6]。研究者认为:在细胞分裂过程中,端粒序列不断丢失导致端粒长度缩短;当缩短至一定长度时,可能触发某种信号,使细胞进入第一死亡期(M1)。如果细胞被病毒转化或受某些抑癌基因(如 P53等)的作用致突变,使其越过 M1期继续分裂,则端粒继续缩短,最终达到第二死亡期(M2)。此时,大部分细胞端粒极度缩短而死亡,但少数细胞在此阶段却激活了端粒酶,其端粒长度趋于稳定,并进一步获得永生化。结果,这些细胞无限制地增殖下去,从而导致了肿瘤的发生。Kanamaru T等[7]利用TRAP检测结直肠癌组织端粒酶的活性并通过RT?PCR检测其hTERT mRNA的水平，结果显示端粒酶的活性和hTERT mRNA的水平随着腺癌的发展稳定地增强。hTERT mRNA 表达与端粒酶活性呈平行关系。Rosenberg R等[8]对结直肠癌组织和正常结直肠肠黏膜各57例，利用DNA印记法测端粒酶的长度和RT?PCR法测端粒酶的hTERT的定量分析显示：在正常结直肠黏膜中测端粒酶的长度和端粒酶的hTERT随年龄的增加而递减，在结直肠癌组织中随着UICC肿瘤的级别递增端粒酶的长度逐渐缩短和端粒酶的hTERT表达逐渐降低。研究认为检测hTERT的表达，能间接反映端粒酶的活性. Liu JL[9]等通过对30个样本，结直肠癌及其癌旁组织，正常黏膜和20个样本腺瘤息肉改良TRAP，酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫组化方法研究端粒酶活性和表达人类hTERT在结直肠癌及其癌旁组织，正常黏膜和腺瘤息肉，并评估其与癌变的进展和结直肠癌。发现端粒酶活性与结直肠癌的发生、发展和转移密切相关，hTERT基因的过度表达，在端粒酶活性的调节中可能发挥关键作用。Zendehrokh N[10]等利用TRAP于46例有转移癌的原位积液中的癌细胞进行端粒酶活性强弱测定，对端粒酶活性强弱在积液中细胞水平的生存时间进行分析。结果显示端粒酶活性的强弱与肿瘤细胞在积液中的生存时间呈正相关。Saleh’ S[11]等对53例结直肠癌和9例结直肠腺瘤利用实时聚合酶链反应（RT ? PCR）技术定量检测hTERT的mRNA表达水平，指出hTERT基因可能是结直肠癌的一种潜在的生物标志物，在人端粒酶成分中，hTERT的表达与端粒酶活性密切相关。人类hTERT被认为是一个可靠的标记端粒酶活性。
2 端粒酶活性与结直肠癌大便脱落细胞
2.1 大便脱落细胞应用与结直肠癌筛查的可行性 目前普遍认为结直肠癌的发生在分子水平上存在逐步累积的癌基因及抑癌基因的突变,这些突变具有肿瘤的特异性,且这些异常细胞不断脱落入肠道,为通过检测大便中异常细胞来诊断结直肠癌提供可能,又鉴于大便检查具有非侵袭性和不需要导泻的优点,因此许多课题组期望从结直肠脱落细胞中找到满意的结直肠癌筛查及早期诊断方法。研究发现结直肠黏膜上皮细胞更新活跃,有学者曾推算1个包含109 数量的1 cm3 大小肿瘤组织如果以正常速度更新,那么在结直肠脱落细胞总量中至少有1 %来源于肿瘤组织。而根据目前研究[12],结直肠癌细胞脱落有以下3个特点:(1)在病程早期即有较多的细胞从恶性肿瘤组织表面脱落;(2)上皮细胞脱落过程中对结直肠黏膜上皮的位置有选择性;(3)含有脱落细胞的黏膜细胞层是逐渐移动的。因此,可以推测:随大便排出体外的结直肠上皮细胞中,肿瘤组织来源的细胞比例超过1%,这就为脱落细胞检测应用于筛查提供了物质基础。
另外,脱落细胞检测应用于筛查具有生物学合理性:(1)结直肠癌的发展是一个多阶段、多步骤的过程,是由于癌基因和抑癌基因的突变积累或 DNA后天性改变引起的,它们以单独或通过相互影响发挥作用;(2)脱落细胞 DNA大便中稳定性好 ;(3)目前 PCR技术及免疫组化等生物技术的发展为脱落细胞DNA及相关蛋白的检测提供了技术保证。
2.2 端粒酶活性在结直肠癌大便脱落细胞中的表达 近年来在大便脱落细胞的端粒酶活性表达与结直肠癌的早期诊断方面引起了研究者的关注，国外研究者曾报道，在结直肠癌患者大便脱落细胞中利用聚合酶链端粒重复扩增(PCR?TRAP)银染技术观察端粒酶活性阳性表达达60.4%。国内骆成玉[13]等,研究了43例结直肠癌患者大便脱落细胞的端粒酶活性表达情况，结果显示62.8%的结直肠癌患者阳性表达。且与Dukes分期、淋巴结转移和癌肿部位均未见显著相关。大便端粒酶检测的敏感性、特异性和阳性预测值分别为62.8%、95.7%和96.4%提示检测脱落细胞端粒酶活性可能是筛查结直肠癌的新手段。王亚国等[14]对45例结直肠癌患者,34例非结直肠癌患者,从新鲜大便中分离脱落细胞并裂解,用聚合酶链端粒重复扩增(PCR?TRAP)银染技术观察端粒酶活性表达情况。同时采用试纸法做受检者大便隐血试验。结果45例结直肠癌患者大便标本中有30例狧粒酶阳性表达,1例结直肠腺瘤、1例溃疡性结肠炎端粒酶表达为阳性,提示大便脱落细胞端粒酶活性检测对结直肠癌的敏感性为66.67%,特异性为94.12%。大便隐血试验中结直肠癌的敏感性为82.22%,特异性为58.82%。两种方法对结直肠癌阳性检出率差异无显著性(P>0.04)。端粒酶阳性表达与其结直肠癌Duke’s分期、淋巴结转移和癌肿部位均未见显著相关(P>0.05)。结论显示大便中脱落细胞端粒酶活性检测有望成为一种新的结直肠癌筛选方法。
3 存在问题和展望
端粒酶已被认为是迄今为止最有特异性和敏感性的肿瘤标志物之一，通过检测端粒酶活性、端粒长度,用于结直肠癌诊断、及预后是一个值得进一步探讨的领域。有着广阔的前景,然而目前对端粒酶动力学、端粒酶作用及调控机制的认识尚不充分。就目前大便脱落细胞检测端粒酶的活性应用于结直肠癌筛查尚处于探索性研究阶段,还存在以下一些问题:(1)大便中含有大量从肛管上皮脱落的鳞状上皮细胞及细菌等物质,它们会影响脱落细胞DNA的稳定性和分离过程,可能导致分离物中有细菌DLA或者影响PCR结果的物质[15]，从而影响脱落细胞端粒酶的活性的检测;(2)结直肠癌发生、发展过程由相互作用的多基因控制,这就导致了检测的复杂性;(3)大便脱落细胞端粒酶活性检测的费用较高,尚不能用于结直肠癌平均风险人群的筛查。
今后,可以从以下两方面加强研究:(1)创新大便脱落细胞分离技术,建立简便、标准化、特异性高的肿瘤细胞分离收集技术;(2)降低检查费用，但如果大量推广应用,其实也并不昂贵。虽然存在以上这些问题,然而,由于其具有无创、患者依从性好、能早期发现病变等优点,取患者的大便检测端粒酶的活性进行结直肠肿瘤的早期诊断具有很大推广应用的价值，有望成为结直肠癌筛查可选的方法之一。
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