浅议青霉素结合蛋白测定技术

    1.2.4竟争性结合试验定量菌液中分别加入不同浓度的甲氧西林保温37℃10min,然后加入饱和量的氛标记青霉素,37℃保温10min,再按上述方法继续进行实验。
    2结果与讨论
    本法测定肺炎链球菌全细胞中pBps的含量,首先需要分离菌体蛋白,为使菌体蛋白浓度维持在一定的水平上,必须控制菌龄和菌液浓度。菌液浓度约CFU/ml。肺炎链球菌破碎细胞的方法以采用离子型去污剂sarkosyl为宜,它能选择性地作用于胞浆膜(3),使胞浆膜破裂,菌体蛋白释放出来,与此同时,已经与青霉素结合的膜蛋白PBPs也一起释放出来。样品制备完毕,煮沸3min,以便除去某些蛋白质的干扰,青霉素与PBPs结合较牢固,不会被破坏。
    本实验采用SDS一PAGE方法(4-5),SDS在分离胶与浓缩胶中的终浓度均为0.1%。分离胶浓度为10%,浓缩胶浓度为5%。
    氖标记物穿透力较弱,用一般放射自显影方法不能得出图象,本实验采用荧光放射自显影法(6-8)(Fluoro,aphy),检测聚丙烯酞胺凝胶片上3H标记的蛋白质,有一定的优点。PPO是荧光增效剂,其作用原理不是直接依赖sH放射出来的日射线,而是藉助3H上的日粒子与PPO相互作用发射出的光,造成x光底片的局部发黑得到深浅不同的暗线,从而获得青霉素结合蛋白的图谱。肺炎链球菌的PBPs图谱上可见有三条区带,即p即;(a,b),pBpZ和pBp3。一般情况下,青霉素浓度越大,亲和力越强,颜色越深,在竞争性试验中,甲氧西林浓度越大,亲和力越强,颜色越浅。
    据报道(7-9),x光底片预曝光可增加荧光放射自显影法的灵敏度,.因为预曝光可以纠正样品放射性和x光底片图象吸收值之间的非线性关系,所以,经预曝光的x光底片上所得到的图象可以正确反映出样品的放射性分布情况。
    用国产x光底片不经预曝光时,无图象出现,经预曝光则有图象出现(见图1),用进口x光底片未经预曝光者,图象的暗线区别不大(见图2)。预曝光后的x光底片显示出暗线深浅不同的正确图象(见图3)。国产x光底片与进口x光底片比较,国产片敏感性较低,预曝后的x光底片上出现的暗线普遍较浅且细,PBPI。不可见。
    参考文献
    1钱海伦.细菌对卜内酞胺类抗生素耐药性的研究进展.中国药科大学学报,1989;20(3):188
    2钱海伦,李静.肺炎球菌生长培养基和菌种保存方法的研究.徽生物学通报,1989;16(l):15
    3  Filip C, Fletcher G, Wulff J. Solubilization of the cytoplasmic membrane of  E. cdi  by  the  ionic detergent  sodium- lauryl sarceginate. J Bial Chem 1973 ; 115 ( 3 ) : 717
    4   Amen GF.  Resolution of bacterial proteins by polyacrylamidrgel electrophoresis on slabs. J Bial Chem 1974; 249(2):293
    5   Zighelboim S.  Mechanism of Resistance to penicillin in Strelrtac 1981,7(3):169
    6   Banner RA, hskey RA.  A film detection method for tritium-labelled proteins and nucleic acids in polyacrylamide gels. 9ra} JBiachem 1974;48,83
    7   Laskey RA, Mills AD. Quantitative film detection of 3H and "C in polyacrylamide gels by fluorography. Eur J BPOCl1NR 1975;58;333
    8   Williamson R, Haokenbeck R, Tomasz A. Is rnvo Interaction of (ilactam  antibiotics  with  the  penicillin- binding  proteins of SLrey(acrocawr ynaanwaiae.  Aalamecrob Agents C 1980;  18(14):629