多指标综合评分法优化更年康颗粒醇提工艺
2.2.2 HPLC-ELSD测定黄芪甲苷含量
色谱条件：采用依利特Hypersil ODS色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：甲醇-水(79∶21)；流速：1 mL/min；ELSD漂移管温度：90 ℃；雾化气流速：2.20 L/min。
线性关系考察：精密吸取1.306 mg/mL黄芪甲苷对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL,分别置于5 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,使浓度分别为0.130 6、0.261 2、0.391 8、0.522 4、0.653 0 mg/mL。分别吸取上述各对照品溶液20 μL,进样,按上述色谱条件测定峰面积值,以峰面积均值的对数值(Y )为纵坐标,进样量的对数值(X )为横坐标,绘制标准曲线。得回归方程：Y＝0.941 6X＋5.720 8,r＝0.999 6(n＝5)。结果表明,黄芪甲苷在2.612～13.06 μg范围内呈良好的线性关系。
含量测定：取按各提取工艺制备的稠膏约4 g,精密称定,加水10 mL,超声溶解30 min,用水饱和正丁醇振摇提取4次,每次40 mL,合并正丁醇液,用氨试液充分洗涤2次,每次40 mL,弃去氨试液,正丁醇液蒸干。残渣加蒸馏水5 mL使溶解,放冷,通过D101型大孔树脂柱(内径1.5 cm,长12 cm),以水50 mL洗脱,弃去水液,再用40%乙醇30 mL洗脱,弃去40%乙醇洗脱液,继用70%乙醇50 mL洗脱,收集洗脱液,蒸干,用甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中,甲醇至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,注入液相色谱仪,每个样品平行进样2次,以外标两点对数方程法计算,测定各样品中的黄芪甲苷含量。结果见表2。
2.3 实验结果
按照L9(34)正交设计表的条件进行实验,分别测得芍药苷、黄芪甲苷的含量。将结果用多指标试验全概率方法进行数据处理,具体运算及公式相关符号的意义可参考文献[1]。根据各指标影响作用的大小,本试验按其重要程度之比为m1∶m2＝芍药苷权重∶黄芪甲苷权重＝0.6∶0.4,计算P(Aj)及各指标的P(B?/Aj)＝Xij/Sj,则综合评分(M)＝P(Bi)2＝P(A1)P(B?/A1)＋P(A2)P(B?/A2)＝0.6 Xi1/S1＋0.4 Xi2/S2。在上述各式中Bi为第i号试验,Aj为第j个指标。Xij表示第j个指标下的第i个测定值,以Sj表示第j个指标下各次(n次)试验结果的和。i＝1, 2……n；j＝1,2……k。数据处理和方差分析见表2、表3。表2 正交试验结果（略）表3 方差分析（略）注：F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00
结果表明,A、B、C、D对试验结果均无显著影响。经直观比较分析,同时结合生产实际,综合比较,确定最优工艺条件为A2B3C3D2 ,即18倍量70%乙醇,分3次回流提取,每次1.5 h。
2.4 最佳工艺验证
取处方药材3份,根据筛选得到的提取工艺A2B3C3D2,进行正交验证试验,得芍药苷含量为1.51%,RSD＝1.51%(n＝3)；黄芪甲苷含量为0.061%,RSD＝1.97%(n＝3)。可见,按优化工艺进行提取,芍药苷、黄芪甲苷均取得较理想的结果。表明该工艺稳定可行。
3 讨论
当处方中有多味药材时,其制剂工艺的评价如采用单一指标则代表性较差,用不同种类的成分作为评判指标其结果才有较广泛的代表性。但由于不同药材中的成分含量有时不在同一数量级,直接累加则使数量级大的对结果的贡献大,而小的贡献小,常不符合组方原则及治则。用多指标正交试验进行工艺优选时,首先需解决指标间量纲不一致和指标间的相容与否的问题,然后需针对指标间的重要性差异给出各指标权重,综合评分后再进行统计分析。在应用此法时,如何设置指标的权重,需根据具体情况具体分析。本方剂需进行醇提的各味药物中因白芍为本方君药,同时黄芪的皂苷类成分在疗效上都将发挥重要作用,故将二者的权重定为0.6∶0.4。
在进行芍药苷含量测定时,由于本处方醇提部分含有4味药,样品中含有一些极性小的物质在样品测定时不易从色谱柱上洗脱,连续进样易造成芍药苷位置附近有杂质干扰,甚至会出现肩峰,影响其分离效果,因此,提取时需对样品进行净化处理,如可以采用乙醚进行脱脂处理,还可以在样品测定时经常用乙腈或纯甲醇对色谱柱进行冲洗,以除去弱极性物质,保证样品的重现性和色谱的分离性能。在对黄芪甲苷进行HPLC-ELSD含量测定中,为了保证色谱条件的稳定性和可重现性,除了雾化器的气体流量、流动相的流速、漂移管的温度对其有决定性影响之外,试验还发现操作环境的湿度对色谱的重现性和分离性能也有重要影响,故还需注意HPLC-ELSD操作环境的湿度。
【参考文献】
[1] 魏 毅,罗杰英.用多指标试验全概率评分法研究茶多酚颗粒制备工艺[J].中国中药杂志,1999,24(5)：279－281.