了哥王中西瑞香素提取工艺的正交实验设计优选
作者：郭君阳，郝桂彤，孙立新
【摘要】 目的优选了哥王中西瑞香素的最佳提取工艺。方法以西瑞香素含量为考察指标，采用L9（34）正交设计的方法优选了哥王中西瑞香素的最佳提取条件。结果了哥王中西瑞香素的最佳提取工艺为：75%乙醇加热回流提取4次，2 h/次。结论此提取工艺简便合理可行，适用于了哥王中西瑞香素的提取。
【关键词】 了哥王； 西瑞香素； 正交设计； 提取工艺
了哥王学名南岭荛花Wikstroemia indica (L.)C. A. Mey，为瑞香科荛花属植物，其根、茎叶和果实均可入药，盛产于广东、浙江、广西等地。了哥王始载于《岭南采药录》，其性味苦寒，微辛，有毒，入肺肝经，具有清热解毒、消肿散结、通经利水等功效。了哥王主要有香豆素类、黄酮类、木脂素类、挥发油类、甾体类、皂苷等成分，文献报道具有抑菌、抗病毒、抗炎镇痛、止咳祛痰、抗癌等作用［1］。西瑞香素（daphnoretin）为香豆素类化合物，在了哥王中含量较大［2］，具有抗病毒［3］、抗肿瘤［4］等作用。了哥王中西瑞香素的提取，文献中采用甲醇为提取溶剂，但甲醇毒性较大，且提取工艺未经优化［5，6］。本实验采用乙醇提取，通过正交实验考察了影响西瑞香素提取工艺的乙醇体积分数、提取时间、提取次数，优选了哥王中西瑞香素的最佳提取工艺，为工业化生产提供实验参考依据。
1 仪器 试剂与药材
1.1 仪器岛津LC-6A 高效液相色谱仪（日本SHIMADZU），ANASTAR 色谱工作站（天津奥特塞恩斯仪器有限公司），分析天平（十万分之一，湘仪天平仪器厂），旋转蒸发器（RE-52AA，上海亚荣生化仪器厂），SHZ-Ⅲ型 循环水真空泵（郑州长城科工贸有限公司），KQ-100 超声机（昆山市超声仪器有限公司），恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）。
1.2 试药西瑞香素对照品（广州来普达克生物技术有限公司，纯度为98.9%），了哥王（购自河北安国市童铃药材有限公司，产地是广东，批号：080522）；甲醇（色谱纯，山东禹王实业有限公司禹城化工厂），纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司），无水乙醇、磷酸为分析纯；了哥王药材由沈阳药科大学孙启时教授鉴定为Wikstroemia indica (L.)C. A. Mey。
2 方法与结果
2.1 西瑞香素的含量测定
2.1.1 色谱条件与系统适用性试验色谱柱：Diamonsil C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm)；流动相：甲醇-0.05%磷酸水溶液(49∶51，V/V)；流速1.0 ml·min-1；检测波长：345 nm；柱温：40℃。在上述色谱条件下，理论板数按西瑞香素计不低于3 000。西瑞香素与相邻峰的分离度均大于1.5，拖尾因子均在0.95～1.05之间。色谱图见图1。
2.1.2 对照品溶液的制备
取西瑞香素对照品约5.0 mg，精密称定，置于100 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得50.0 μg·ml-1储备液。
2.1.3 供试品溶液的制备取了哥王药材约10 g，精密称定，置于圆底烧瓶内，加75%乙醇浸泡过夜，药材∶溶剂=1∶10，次日于80°水浴中回流提取4次，2 h/次，热滤，合并滤液，减压蒸干，所得浸膏用甲醇溶解并转移至100 ml量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取1 ml于50 ml量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm滤膜过滤，取续滤液即得。
2.1.4 标准曲线绘制依次精密吸取西瑞香素标准储备液0.4，0.8，1.6，2.4，3.2，4.0 ml，分别置于10 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配成西瑞香素浓度分别为2.0，4.0，8.0，12.0，16.0，20.0 μg·ml-1的系列标准溶液。吸取20 μl上述溶液依次注入高效液相色谱仪中，于345 nm波长处测定峰面积。以西瑞香素标准溶液的浓度(μg·ml-1)为横坐标(X)，峰面积(A)为纵坐标(Y)，进行线性回归。所得回归方程为Y = 6.183×104 X + 5.492×103， r = 0.999 9 (n = 6)。结果表明，西瑞香素在2.0 ～ 20.0 μg·ml-1范围内呈良好的线性关系。
2.1.5 精密度实验
取同一对照品溶液，按上述色谱条件，重复进样6次，20 μl/次。测定西瑞香素峰面积，其RSD为1.1%，表明该方法的精密度良好。
2.1.6 稳定性实验
取同一供试品溶液，分别于0，2，4，8，16，24 h按上述色谱条件，进样20 μl测定西瑞香素峰面积，RSD为1.6%，表明西瑞香素在24 h内稳定。
2.1.7 重复性实验
精密称取了哥王药材6份，按“2.1.3”项下方法制备并测定，RSD为1.7%，表明此方法的重复性良好。
2.1.8 加样回收率实验
称取已知含量的了哥王药材6份，每份约5 g，精密称定，分别定量加入西瑞香素对照品约20 mg，按“2.1.3”项下方法操作，计算回收率。平均回收率为98.3%，RSD为1.7% 。