马兰对动物离体子宫的兴奋作用及促凝血的实验研究
【摘要】 目的探讨马兰乙醇提取物对己烯雌酚预处理后大鼠、小鼠离体子宫的兴奋作用和对家兔体外凝血功能的影响。方法常规方法制备动物离体子宫标本，采用BL-420生物机能实验系统记录离体子宫平滑肌的活动, 以子宫收缩的幅度、频率及收缩力作为指标, 观察马兰乙醇提取物对注射己烯雌酚后大鼠、小鼠离体子宫兴奋作用，计算兴奋子宫的IC50，以益母草为阳性对照。促凝血采用家兔体外复钙和对凝血酶原(PT)的影响。结果马兰95%乙醇提取物和50%乙醇提取物对大鼠和小鼠离体子宫平滑肌有明显地兴奋作用，可加快收缩频率、提高收缩张力和子宫活力(P＜0.05，P＜0.01)，并呈量效关系。马兰50%乙醇提取物能明显缩短复钙凝血时间(P＜0.01)，对凝血酶原时间无明显影响。结论马兰95%乙醇和50%乙醇提取物对大鼠和小鼠离体子宫平滑肌具有兴奋作用，其兴奋子宫平滑肌的作用强度较益母草稍强。并具有促凝血作用。
【关键词】 马兰； 离体子宫； 兴奋作用； 凝血时间； 凝血酶原
马兰Kalimeris indica (L.)Sch-Bip为菊科马兰属植物，全草可入药。据《本草纲目》记载：马兰可“破宿血、养新血, 止鼻吐血、合金疮、断血痢、解酒疸、诸菌毒、蛊毒”及治“腹中急痛, 痔疮”等病症。马兰又称鱼鳅串、鸡儿肠、路边菊、田边菊等，分布于我国的江苏、浙江、江西、福建、湖南 、湖北 、广东、广西、四川、贵州等地［1］。马兰味苦、辛，性温、寒，以全草或根入药，有清热解毒，散瘀止血，温肺止咳，散寒止痛，消积之功效，主治感冒发热，咳嗽，急性咽炎，扁桃体炎，流行性腮腺炎，传染性肝炎，胃、十二指肠溃疡，小儿疳积，肠炎、痢疾、吐血、崩漏、月经不调、外用治疮疡肿毒、乳腺炎、外伤出血、肺寒喘咳、胃脘冷痛等［2］。广西少数民族有用马兰治疗功能性子宫出血，崩漏等妇女出血性疾病之经验，并获得良好的疗效。据报道全叶马兰乙醇提取物，对蛋清所致大鼠足趾肿胀及二甲苯所致小鼠耳廓肿胀有抑制作用，对大鼠钾离子皮下透入致痛法与小鼠扭体法有抑制作用，显示出良好的抗炎镇痛作用［3］。药效学还研究表明马兰具有良好的镇咳和中枢抑制作用［4］。而马兰兴奋子宫和对凝血功能的实验研究未见报道。本文采用BL420生物机能实验系统，观察马兰乙醇提取物对注射己烯雌酚后的大鼠、小鼠离体子宫的影响及对凝血功能的影响。现报道如下。
1 材料与仪器
1.1 药品与试剂
马兰采自桂林地区（经桂林医学院药学系生药教研室王育生副教授鉴定），晒干备用。益母草购自桂林市药材市场。取马兰1 000 g，用中药材粉碎机粉碎后置于5 000 ml圆底烧瓶中加95%乙醇浸没，加热冷凝回流1 h，抽滤，重复上述操作3次；另取马兰800 g 加50%酒精浸没，加热冷凝回流1 h，抽滤，重复3次。分别用旋转蒸发仪将两种组分浓缩，45℃烘干后置冰箱备用。益母草提取方法与马兰相同。
己烯雌酚注射液，天津金耀氨基酸有限公司，批号200801241；凝血酶原(PT)时间试剂盒，上海太阳生物技术有限公司，批号105035；云南白药，批号20081113，云南白药集团股份有限公司。
1.2 动物Wistar大鼠，雌性，未孕，体质量（220±20）g；昆明种小鼠，体质量（30±2）g；家兔，体质量（2.2±0.2）kg；均由桂林医学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK(桂)2007-0001。
1.3 仪器SYC-15超级恒温水浴，北京桑力电子设备厂产品；旋转蒸发器（RE-52AA），郑州长城科工贸有限公司产品；BL420生物机能实验系统，成都泰盟科技有限公司产品。
2 方法
2.1 大鼠和小鼠离体子宫平滑肌张力的测定取正常未孕大鼠12只、小鼠12只，实验前24 h腹腔注射己烯雌酚，剂量分别为大鼠1 mg·kg–1，小鼠2 mg·kg–1，人工造成动物动情前期或动情期，以提高子宫敏感性。实验时大鼠、小鼠脱颈椎处死，迅速剖腹取出子宫，分离子宫壁上附着的结缔组织和脂肪组织，立即置于盛有营养液的玻璃皿中。将上述动物离体子宫标本阴道端系在盛有20 ml营养液（大鼠用DeJaion氏液［5］、小鼠用Tyrode［5］氏液）的麦氏浴槽L型通气管上，另一端与张力换能器（大鼠用0～5 g张力换能器、小鼠0～3 g用张力换能器）相连，通入氧气，每秒1个小气泡，麦氏浴槽控温在（36±0.5）℃。将BL-420生物信号采集系统，定标，调零，时间常数T=DC，G=20 mv，滤波调节F=20 Hz（小鼠F=50 Hz），扫描速度S=12.50 s/div［5］。实验前负荷（小鼠0.5 g、大鼠1 g），待稳定15 min后，开始实验。加入马兰或益母草95%乙醇组分和50％乙醇组分溶液，由低浓度到高浓度。给药后记录10 min离体子宫的收缩活动，每加入一个浓度药物待子宫平滑肌收缩达高峰后，更换营养液，冲洗3次，待离体子宫平滑肌稳定后，再加下一个药物浓度。直到测出该段子宫平滑肌收缩的最大效应（此时增加剂量不再增加收缩高度）。用Windows2007, Microsoft Excel数据分析工具，计算IC50，并计算子宫收缩强度、频率和子宫收缩活力。数据用t检验进行统计学处理。
2.2 体外凝血实验取家兔6只，心脏取血，加入3.8%枸橼酸钠抗凝管(抗凝剂与血按1∶9)中， 轻轻混匀，制备抗凝血液。抗凝血浆的制备：抗凝血液经3 000 r/min，离心10 min，取上清液备用。
将马兰50%乙醇提取物、云南白药粉剂溶于生理盐水，配制成1％浓度，进行凝血时间(全血复钙时间，血浆凝血酶原时间)的测定［6］。以云南白药为阳性对照，生理盐水为空白对照。全血复钙试验：取抗凝兔血0.7 ml加生理盐水或马兰或云南白药药液0.1 ml于试管内，置37℃水浴中孵育5 min，加入1/40 mol氯化钙0.1 ml，每隔30s轻轻倾斜试管1次，观察有无凝血，从加入氯化钙溶液开始记时，到倾斜试管血块凝固于管底而不流动时为止，即为凝血时间［7，8］。凝血酶原测定：按凝血酶原试剂盒说明操作，血浆0.1 ml，加PT试剂0.1 ml，对照组加30 μl生理盐水，给药组加药液30 μl，在有机玻璃板的凹坑内37℃孵育3 min，用大头针混匀，每隔3 s挑1次，直至出现凝块即为凝血酶原时间。每药重复试验3次，取其平均值，与生理盐水组比较求出凝血时缩短的程度。用t检验进行统计学处理。