地鳖纤溶蛋白对荷S180和H22小鼠的抑瘤作用研究
3 结果
3.1 EFP分离纯化与成分测定地鳖经匀浆、盐析和透析得到EFP粗提物，将其过DEAE-52离子交换纤维素离子交换柱层析分离，经1 mol/L NaCl梯度洗脱，洗脱液经核酸蛋白检测仪检测，出现了2个蛋白峰，其中峰1蛋白含量极低，峰2蛋白含量较高。因而，收集峰2样品。峰2蛋白经SDS-PAGE检测，根据标准蛋白计算EFP的3个蛋白亚基EFP1、EFP2、EFP3，相对分子质量分别为74.9KD，71.5KD，65.2KD。
参照尿激酶标准曲线测得冻干蛋白的纤溶活力为20 U/mg。经蒽酮法和考马斯亮蓝法测定地鳖纤溶蛋白冻干粉中糖含量为82.8%，蛋白质含量为17.2%。
3.2 EFP对小鼠S180腹水瘤的抑制作用实验结果表明高、中两个EFP剂量组和环磷酰胺均能显著抑制S180腹水的生成，减少瘤细胞数量，高剂量EFP抑瘤率达69.56%；中剂量EFP抑瘤率为30.76%，小鼠的生长状态良好，而低剂量EFP抑瘤效果很差，抑瘤率仅为3.98%。结果见表1。与生理盐水组相比3个EFP处理组瘤细胞数量均明显减少，其中，高剂量组最为显著，中剂量组次之，低剂量组与环磷酰胺组相似。表明EFP对S180腹水瘤抑制效果明显。表1 EFP对S180腹水瘤的抑制作用（略）
3.3 EFP对小鼠S180、H22实体瘤的抑制作用实验结果表明，高、中、低3个EFP剂量组和环磷酰胺均能抑制S180实体瘤的生长，高剂量EFP抑瘤率为37.48%，中剂量EFP抑瘤率为34.37%，低剂量EFP抑瘤率为25.77%，环磷酰胺抑瘤率35.59%。结果见表2，但该组小鼠体质量和脾重均最小，生理盐水组其次，而EFP 3个药物组体质量和脾增重最高，表明EFP毒性较低。结果见表2。表2 EFP对S180实体瘤的抑制作用（略）
EFP对H22实体瘤作用结果见表3。高，中，低3个剂量结果来看，低剂量组的抑制率最高，达41%，中剂量组抑瘤率为36%，与环磷酰胺抑瘤率37%相似，高剂量抑瘤效果反而较差，抑瘤率仅为24%。环磷酰胺组小鼠体重和脾重最小，生理盐水组其次，药物组最高。表3 EFP对H22实体瘤的抑制作用（略）
3.4 EFP含药血清及EFP对细胞增殖的反应不同浓度的EFP含药血清和EFP分别作用于H22细胞株，于48 h采用MTT法检测各组血清对H22细胞株增殖的抑制率（见表4～5）。结果表明，两组EFP含药血清组对H22细胞的增殖均有抑制作用，抑制作用呈一定的量效和时效关系，即随着含药血清浓度的增加，抑制率逐渐增加；而各组EFP对H22细胞的增殖则没有抑制作用，反而对其具有明显促进作用，说明EFP没有细胞毒性。表4 EFP小鼠含药血清对H22细胞抑制作用 （10%），表5 EFP对H22细胞抑制作用（略）。
4 讨论
目前临床抗癌药物主要为化疗剂，其对肿瘤细胞有直接抑制和杀伤作用，但是，传统的化疗主要着眼于对癌细胞的杀伤，药物存在难以避免的毒副作用，如化疗药物对正常分裂细胞毒性很强，极易造成患者白细胞与血小板减少以及贫血等骨髓抑制症状，成为制约其进一步发展的障碍，再者，肿瘤细胞对化疗剂易产生抗药性，也是导致抗癌治疗失败的主要原因之一。近年来,研究发现中草药无论在抑制肿瘤细胞,还是在肿瘤的病后调理、改善体征、减轻放、化疗不良反应等方面均发挥了重要作用［6］。临床实践证明一些复方的覆盖面较广，但是作用较弱；而一些单味中药定向作用于某些肿瘤，且抑瘤效果显著［7］。
地鳖为我国传统中药，具有显著活血化瘀与抑瘤功效,但其纤溶作用与抑癌作用有何内在相互联系,目前尚未见有关报道，本实验从地鳖中分离纯化得到的纤溶活性蛋白(EFP)，前期实验已证明其具显著抑制血管生成的作用［8］。 通过本文实验证明,EFP无明显细胞毒作用,而对荷瘤小鼠却存在显著的抑瘤效果,在EFP浓度2.90 mg·kg-1对S180腹水瘤、2.18 mg·kg-1对H22肝癌和0.73～1.45 mg·kg-1对S180实体瘤的荷瘤小鼠的肿瘤生长有明显抑制作用, 在S180实体瘤实验中，高浓度EFP对小鼠的抑瘤率与环磷酰胺相似，在H22实体瘤实验中，在低浓度（0.73 mg·kg-1）下，抑瘤率最高，通过脾重测定，可知在高浓度下小鼠脾重最大，说明，地鳖蛋白对S180和H22肿瘤细胞均具一定的抑制作用，且抑制效果和环磷酰胺相差无几。实验表明EFP对S180等细胞无杀伤效果，说明EFP抗肿瘤作用不是通过直接杀伤肿瘤细胞，我们认为EFP对小鼠移植瘤的生长抑制作用很可能与其纤溶酶活性有关，与纤溶酶抑制肿瘤血管生成关系密切。
许多疾病的病理过程都涉及到新生血管生成，包括肿瘤生长等疾病。早在1971年Folkman就提出了“肿瘤生长依赖血管生成”的观点，并提出了“抑瘤与抗血管生成的概念”。近年来大量研究已证明肿瘤血管生成在肿瘤的发生发展中起到至关重要的作用，肿瘤组织既可通过肿瘤血管从宿主获取营养和氧气，又可通过肿瘤血管向机体的其他部位输送转移细胞，继续生长和诱导血管形成，导致肿瘤转移［9］。中医也认为肿瘤的发生是由于正气不足，脏腑功能失调，气滞、血淤、痰凝、毒聚而形成。现代医学证实，癌症患者血液（浆）多呈高粘高凝状态，这不仅阻碍药物对肿瘤细胞的直接杀伤作用，而且有助于癌细胞的转移、定居和增殖。活血化淤中药抑癌理论提出，活血化淤中药通过改善患者血液黏滞状态，改善血液循环,增加局部血流量,改善局部缺氧,而抑制瘤栓的形成，使肿瘤细胞不能在血循环中存活［10］，这样对血瘤细胞起到了直接或间接的抑杀作用，从而达到防治恶性肿瘤血行转移的目的，同时也使抗癌药物及其它成分易于深入瘤体而充分发挥作用。
有关研究表明，活血化淤药物影响肿瘤生长及转移机制与抑制新生血管生成关系密切，有关研究证明纤溶活性蛋白酶及其活性产物,可以大量降解肿瘤细胞外基质,使肿瘤细胞丧失生存的环境基础,而且导致肿瘤组织自身的降解,反而不利于肿瘤的侵袭转移［11］，纤溶活性物质具有抑制内皮细胞增生，从而阻碍肿瘤血管的形成和肿瘤转移灶建立的作用。基于上述理论，我们认为EFP的抑瘤效应可能与其对肿瘤新生血管的抑制作用有关。为此，我们认为EFP很可能是地鳖中的一种有效、低毒的抗肿瘤成分，其主要有望在抑制肿瘤生长和转移方面发挥效应，是一个具有应用前景的抗肿瘤天然药物。
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