基于1H NMR 代谢组学的阳明经穴特异性研究
作者：吴巧凤，徐世珍，余曙光，颜贤忠，唐勇，刘娟，毛森，周思远，梁繁荣
【摘要】 目的采用基于核磁共振(1H nuclear magnetic resonance，1H NMR)和模式识别技术的代谢组学方法分别观察针刺阳明经穴与他经穴位对健康男性尿液代谢产物的影响，从针刺对机体代谢流影响的角度探讨阳明经穴的特异性。方法60例健康青年男性随机分为足三里组，梁门组，巨髎组，阳陵泉组，委中组和空白对照组，每组10例。分别针刺相应穴位，连续针刺5 d，获取受试者晨尿，采用1H NMR检测尿液代谢物，运用主成分分析和正交偏最小二乘判别分析等模式识别方法分析所得数据。结果针刺阳明经穴对机体尿液代谢物的影响基本一致，均可以升高尿液中马尿酸和氧化三甲胺的含量，降低甘氨酸含量;针刺阳明经穴与针刺阳陵泉对尿液代谢物的影响差别不大，但与针刺委中后的差别明显;针刺委中后尿液代谢物中肌酐明显升高。结论对尿液代谢物的模式识别分析显示，阳明经穴具有一定的共性，但与阳陵泉的差别不明显，与委中的差别较为明显，有关原因尚需进一步深入研究。
【关键词】 针灸;经穴特异性;阳明经;代谢组学
经穴特异性理论是阐明经穴功能和指导针灸临床治疗的重要基础，也是发展经络理论、评价针灸疗效的重大选题[1，2]。本研究从整体代谢流的角度，采用目前系统生物学中以观察复杂系统终端产物为代表的代谢组学检测技术和数据分析方法，对针刺阳明经和他经穴位后机体尿液代谢物进行分析，从针刺对机体代谢流影响的角度探讨阳明经的特异性，为经穴特异性研究提供新的生物信息学依据，为代谢组学相关技术和数据分析方法在经穴特异性这一新领域的应用提供借鉴。
1研究对象
受试者均为男性健康志愿者，汉族，年龄20～25岁，体质量指数18～24。经检查受试者无糖尿病、柯兴氏综合征、甲状腺功能低下、性腺功能低下等代谢功能异常，无心脑血管疾病，无肝、肾功能不全或重要器官功能障碍，无精神疾患，无吸烟、嗜酒等不良嗜好。共收集60例受试者，随机分为6个组，分别为足三里组，梁门组，巨髎组，阳陵泉组，委中组，和空白对照组，每组10例。
2方法
2.1穴位治疗试验前所有受试者接受标准化饮食1周，忌辛辣刺激饮食，避免剧烈运动。受试者每日固定时间接受针刺治疗，分别针刺相应的穴位并得气后，在相应穴位附近旁开0.5 cm处再浅刺一针，不得气，作为辅助电极，连接G6805II电针仪，采用疏密波，频率为16次/min，电压220 V，逐渐加大电流至能耐受为度(有明显的震颤感，但又不过分强烈) 。1次/d，30 min/次，连续针刺5 d。空白对照组不给予任何针刺刺激。针刺全部结束后第2天收集受试者晨尿，10 000 r/min 离心10 min，获取尿液上清样本。
2.21H NMR数据采集和分析取350 μl的尿液，分别加入30 μl的TSP/D2O(1 mg/ml)，350 μl磷酸缓冲溶液，充分振荡混匀后，13 000 r/min离心10 min。取600 μl上清加入5 mm核磁共振管中混匀，待用。样本分别进行1H-NMR实验。采用有预饱和的1D NOESY脉冲序列，取如下参数：谱宽8 000 Hz，混合时间0.15 s，驰豫延迟时间2 s，采样点数32 k，累加次数64次;在驰豫延迟和混合期间采用预饱和方式抑制水峰，谱仪偏置设置在水峰的位置。FID信号经过填零为64 k点之后，再加上0.5 Hz的线增宽因子，经傅立叶变换转换为NMR图谱。以TSP为化学位移参考峰的位置，并定为δ0。对所得NMR数据经傅立叶变换得到谱图，经相位校正和基线校正之后，对一定区间内的谱图按每段0.04 ppm的宽度进行分段积分，同时排除包含溶剂峰和尿素峰的部分(δ 4.6～6.2)。其中NOESY数据积分范围为δ 0.4 ～9.4。将积分按每张谱的总积分强度归一化。所得数据输出并转换到Excel文件保存。
2.3模式识别分析将保存的Excel格式数据输入到SIMCA-P+软件(v10.04，Umetrics，Ume，Sweden)进行模式识别分析。数据采用Pareto标度化(Pareto scaling)进行预处理之后;再采用正交信号校正(OSC，orthogonal signal correction)滤噪，然后再进行PCA和PLS-DA分析。分析结果以得分图(scores plot)和载荷图(loadings plot)的形式表示。
3结果
3.1针刺阳明经穴对机体尿液代谢的影响分别针刺足三里，梁门和巨髎后机体尿液代谢物的改变如图1a所示。结果显示3个组在得分图上均分布于PC1的2SD范围内，即各组经模式识别后分离趋势不明显。表明针刺这3个穴位对机体的尿液代谢影响效果较为一致。但与空白对照组相比，针刺阳明经穴后尿液代谢物明显不同(图1b)，模式识别后与空白对照组分布于不同区域，阳明经穴各组主要分布于得分图的PC2正方向，而空白对照组主要分布于PC2负方向。对应的因子载荷图(图1c)显示，针刺阳明经穴可以明显升高尿液中肌酐(δ 3.06,4.06)，马尿酸(δ 7.82，4.06)和羟基丁酸(δ 3.98)的含量，降低甘氨酸(δ 3.58)的含量。足三里组 (■)、梁丘组(●)、巨髎组(◆)与空白对照组()图1针刺阳明经穴位后血浆代谢物模式识别结果
3.2针刺阳明经穴与针刺阳陵泉对机体尿液代谢的影响针刺阳明经穴与针刺阳陵泉穴后机体尿液代谢物经模式识别分析后显示，各组有差别，但差别不明显，表现为在得分图上聚类分布的趋势较不明显，提示针刺阳明经穴与针刺阳陵泉对机体尿液代谢的影响似乎差别不大。足三里组 (■)、梁丘组(●)、巨髎组(◆)与阳陵泉组(▲)图2针刺阳明经穴位与阳陵泉后尿液代谢物的比较结果
3.3针刺阳明经穴与针刺委中对机体尿液代谢的影响比较针刺阳明经穴与针刺委中之后机体尿液代谢改变的异同可以看出，针刺委中组在得分图上主要分布于左上方，成聚类分布的趋势，与阳明经各组分布范围明显不同(图3a)。对应的因子载荷图(图3b)显示，造成委中组与其它各组差别的主要物质是肌酐(δ3.06，4.06)明显升高，而针刺阳明经穴主要表现在尿液中马尿酸(δ 7.82，4.06)和氧化三甲胺(δ 3.26、δ 7.54)的升高。