逆转录-聚合酶链反应法检测消瘤保肺丸对E-cad、α-catenin及β-catenin表达的影响
2.6逆转录反应(ReverTra Ace-α-TM)取200μl EP管，依次加入RNase Free H2O 6 μl,5×RT Buffer 4 μl,dNTP Mixture 2 μl,RNase Inhibitor 1 μl,Oligo(dT)20 1 μl,RNA 5μl,ReverTra Ace 1 μl;所得总反应体系共20μl，混匀后瞬间离心10 s，置PCR 仪中30℃ 预热10 min，温度依次调至：42℃ 20 min,99℃ 5 min,4 ℃ 5 min;按此过程顺序为一个循环。置低温离心机中，瞬间离心。合成所得cDNA于-80℃保存。
2.7聚合酶链式反应(PCR)取200μl EP管，依次加入cDNA 1 μl，dNTP 1 μl，Taq酶 1 μl，10×PCR Buffer 5μl，MgCl2 3 μl，序列特异性上游引物1 μl，序列特异性下游引物1 μl，β-actin上游引物(600bp)1μl，β-actin下游引物(600bp)1 μl，RNA Free H2O 35 μl。所得反应体系共50 μl，混匀后瞬间离心10s。根据引物的不同，退火温度不同，如下：E-cadherin 52℃;β-catenin 50℃;α-catenin 53℃;置PCR仪中温度依次调至：94℃ 2 min(预变性)，94℃ 30s(变性)，50～53℃ 30 s(退火)，72℃ 2 min(延伸)，72℃ 6 min(总延伸)，4 ℃ ∞。第2，3，4步按顺序三步为一个循环，共进行32个循环。扩增所得DNA于-80℃保存。
2.8凝胶电泳取琼脂糖0.26 g放入一干净三角烧杯中，加入RNA Free H2O 11.7 ml、10×TBE缓冲液1.3ml，共13 ml，将三角烧杯置于微波炉中，中火加热，见有气泡出现随即停止加热，反复7～8次，待琼脂糖完全溶解且无气泡产生时，置常温下冷却至稍烫手。带一次性手套，加入EB染色剂2 μl，摇匀。迅速将温热的凝胶倒入已置好梳子的电泳板中，在室温下放置30 min。取10×TBE缓冲液6 ml，配成60 ml溶液加入电泳槽中，将凝胶完全淹没于电泳槽液体中，凝胶的孔朝向电泳槽负极。取加样缓冲液(Loading Buffer)1 μl滴于干净塑料手套上，滴加PCR产物DNA 8 ml与1 μl Loading Buffer混匀，加入凝胶的孔中;加入PCR Marker 5ml于凝胶另一孔中。点样顺序为PCR Marker、消瘤保肺丸高剂量组、消瘤保肺丸低剂量组、清肺化痰丸组、空白对照组。接通电源调至电压90V，电流300 mA，30 min。将凝胶置于图像记录分析系统中观察电泳荧光情况，拍照记录，应用加拿大Glyko公司BandScan 5.0软件分析，计算目的条带与β-actin条带的灰度值之比。见图1及表1。 A-消高组B-消低组C-清肺组D-空白组图1 粘附分子在PG细胞中各组电泳结果表1电泳凝胶的灰度值之比
2.9统计采用SPSS 13.0统计软件处理，方法选用One-Way ANOVA检验。
3结果
消瘤保肺丸高剂量组对3种分子的表达与空白组差异显著，P <0.01。消瘤保肺丸低剂量组α-catenin、β-catenin表达与空白组差异显著，P <0.05;E-cadherin表达与空白组无显著差异，P >0.05。清肺化痰丸组大多与空白组无显著差异，只在α-catenin的表达与空白组差异显著，P <0.05。
4讨论
粘附是肿瘤转移过程中的一个关键环节。肿瘤细胞表面粘附分子与肿瘤的侵袭、转移密切相关，通过表面粘附分子与细胞外基质或细胞等的配体相结合，启动了细胞内各种信号通路，同时也改变了肿瘤细胞的一些特性。孙宏新等[3]研究发现益肺清化膏可有效地提高 E-cad 的表达，降低 CD44v6 的表达水平。
本实验结果表明消瘤保肺丸对粘附分子在人PG肺癌细胞中的表达有显著影响。对E-cadherin的影响比较明显，在空白组表达相对消瘤保肺丸高剂量组降低，说明E-cadherin的表达与消瘤保肺丸高剂量作用成负相关，而α-catenin、β-catenin则与消瘤保肺丸高剂量作用成正相关。通过与空白组比较消瘤保肺丸对各个分子表达的影响较大，以高剂量作用更为明显;清肺化痰丸组α-catenin的表达与空白组有显著差异，说明该药中与消瘤保肺丸的化痰类药物可能对肺癌细胞有一定作用。
中成药消瘤保肺丸的干预作用在细胞实验中有所体现，我们通过对细胞进行干预，在RT-PCR的各个步骤，形成具有中药干预效应的肺癌细胞DNA，其表达效果与正常不同。细胞生长和增殖过程包括转录、逆转录的过程，是合成DNA的重要方面，由此可知，消瘤保肺丸在抗肿瘤侵袭和转移的过程对DNA合成有一定影响。发挥中医药抗肺癌转移的优势，加强复方、验方的分子生物学水平研究，对指导今后临床的用药有重要意义。
【参考文献】
[1]Jou T, Stewart DB, Stappert J, et al.Gentic and bio-chemical dissection of protein linkages in the cadherin-catenin complex[J]. Proc Natl Acad Sei,1995,92(11):5067.
[2]杨剑锋，廖粤军.E-cadherin/catenins与肿瘤发生、侵袭及转移 [J].南华大学学报·医学版，2002，30(4)：392.
[3]孙宏新，蒋士卿，朴炳奎.益肺清化膏含药血清对肺癌细胞株的抑制作用 [J].中医研究，2005，18(10)：12.