逆转录-聚合酶链反应法检测消瘤保肺丸对E-cad、α-catenin及β-catenin表达的影响
【摘要】 目的研究消瘤保肺丸对人肺癌PG细胞中E-cad、α-catenin及β-catenin表达的影响。方法采用逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)检测E-cad、α-catenin及β-catenin表达的情况。随机分为四组，即消瘤保肺丸高剂量组、消瘤保肺丸低剂量组、对照组及空白组，分析电泳凝胶的灰度值。结果消瘤保肺丸高剂量组对3种分子的表达与空白组差异显著，(P<0.01)。消瘤保肺丸低剂量组α-catenin、β-catenin表达与空白组差异显著，(P<0.05);E-cad表达与空白组无显著差异，(P>0.05)。在α-catenin的表达与空白组差异显著，(P<0.05)。结论消瘤保肺丸对人肺癌PG细胞的E-cad、α-catenin及β-catenin的表达有明显影响，消瘤保肺丸对肺癌有一定的抑制作用，该实验为今后分子水平的进一步研究提供了依据。
【关键词】 逆转录-聚合酶链反应;消瘤保肺丸;E-cad、α-catenin及β-catenin;人肺癌PG细胞
上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)是维持上皮细胞形态及同种细胞间粘附连接的主要粘附分子。α-连接素(α-catenin)是E-cadherin连接细胞骨架所必需的成分，E-cadherin借助于α-catenin连接在E-cadherin与β-catenin之间[1]。大量的实验证实E-cad/catenins复合物介导细胞同质粘附而具有抑制肿瘤侵袭、转移的作用[2]。消瘤保肺丸中成药制剂，在临床用于肺癌已有多年，本篇通过PCR等相关手段研究消瘤保肺丸对E-cadherin、α-catenin及β-catenin表达水平的影响，以探究中药抗癌转移的作用机制。
1材料与仪器
1.1药物消瘤保肺丸，仪器由河南省中医院院内制剂室提供，批号：20070514;清肺化痰丸，昆明中药厂有限公司，国药准字Z53020763，批号：080119。
1.2动物及瘤株PG 细胞(即人高转移性巨细胞肺癌细胞株)，由北京广安门医院提供;日本大耳白兔8只，购于郑州大学动物实验中心，动物合格证号：8cxk(豫)2005-2002。
1.3试剂RPMI-1640培养基，美国Gibco公司，编号1313945;优级胎牛血清，天津TBD公司，编号Df-1055;PCR试剂盒，北京Promega 公司，编号m-7501;RT Fsk-100试剂盒，日本Toyoto公司，编号76660C3;Trizol Reagent，美国Gibco公司，编号1373341;DEPC原液，Sanland-Chem International Inc，0532B73;Goldview染色剂，北京赛百盛公司，编号Jun-04-2010。
1.4仪器二氧化碳培养箱HF90型，上海力新HEAL FORCE;图像记录分析系统，大连Jim-X Scientific，编号D140;PCR GeneAmp System，美国Applied Biosystems，编号2700;电泳仪，北京市六一仪器厂，编号DYY-6C。
2方法
2.1 动物分组与模型建立
2.1.1动物分组8只健康日本大耳白兔，随机分为消瘤保肺丸高剂量药物组、低剂量药物组，清肺化痰丸对照组，空白组4组，每组2只，每组每天早晚各给药1次，10 ml/kg/次，其中高、低剂量组分别相当于人等效剂量的10，5倍，空白组给以等量生理盐水，连续给药3 d。
2.1.2动物模型建立空白组(每组每天早晚各灌胃生理盐水1次，10 ml/kg/次);对照组(每组每天早晚各灌胃1次，清肺化痰丸1 g/kg);消瘤保肺丸高剂量组(每组每天早晚各灌胃1次，共消瘤保肺丸1.5 g/kg);消瘤保肺丸低剂量组(每组每天早晚各灌胃1次，共消瘤保肺丸3 g/kg)。
2.2药物制备实验用药剂量参考药物说明书。清肺化痰丸：实验时以纯净水配制成10%的浓度供试;消瘤保肺丸：实验时以纯净水配制成10%的浓度供试。
2.3细胞培养复苏PG冻存细胞，培养基选用含20% 优级胎牛血清的RPMI-1640培养基，隔日或每日换液1次，直至基本贴满下壁，细胞传代，每培养瓶中加2 ml 0.25% 胰蛋白酶液使细胞脱壁，加入8 ml培养基，反复吹打后分入5 ml至新培养瓶。观察细胞生长状态良好，分别加入各组含药培养基，放37℃ CO2培养箱培养48 h。
2.4引物设计特异性引物(E-cad、α-catenin、β-catenin)，采用“Premier Primer 5”软件，由北京赛百盛生物技术公司制作。
2.5RNA提取观察细胞基本贴满，PBS缓冲液冲洗3次，每次5ml;加入Trizol Reagent 1 ml (1 ml/15 m2)，轻摇使Trizol充分接触瓶壁。将Trizol Reagent处理的细胞液转移至0.1% DEPC处理过的1.5 ml EP管(已消毒)，室温静置5 min，加入氯仿0.2 ml，剧烈混匀15 s，室温静置2~3 min。低温离心机中，4℃下12 000 r/min离心15 min，上清液中即含有所需之RNA。取上清液至另一1.5 ml EP管，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温静置10 min，4℃下12 000 r/min离心15 min。弃上清，加入75% 冷乙醇1 ml(即先加入750 μl 预冷无水乙醇，再加入250 μl RNA Free H2O)。颠倒混匀，清洗，悬浮沉淀。4℃下9 000 r/min离心15 min，弃上清，室温晾干。将RNA溶于30 μl RNA Free H2O中。