丹红注射液对睡眠剥夺大鼠学习记忆的影响

　　3讨论

　　小平台水环境法(“flower pot” technique)是研究SD的常用方法，该方法主要剥夺大鼠的REM睡眠。既往研究[4]认为REM睡眠对学习记忆的获得有重要意义，REM睡眠剥夺影响学习记忆能力。丹红注射液是中药丹参和红花的复方制剂，其主要成分有丹参酮、丹参酚酸及红花黄素等, 有改善微循环、抗氧化损伤、脑损伤保护作用[5]。由于中药起效慢，作用时间长，研究认为一般用药时间至少3~7 d。因此，本实验选择7.2 ml/kg为给药剂量，给药1次/d，连续给药7 d，给药完毕即进行SD。图2睡眠剥夺大鼠Morris水迷宫测试游泳距离比较图3睡眠剥夺大鼠Morris水迷宫测试穿越平台次数比较图4睡眠剥夺大鼠海马GFAP含量光密度值比较本研究使用的Morris水迷宫中，PNT主要考察大鼠的空间分辨学习能力，SPT主要测量大鼠的记忆保持能力、工作记忆。研究结果表明，大鼠经过SD后，其学习记忆能力受影响，表现为PNT潜伏期延长、游泳路程增加，但SPT穿越平台次数则无明显差别，说明REM期SD对大鼠在Morris水迷宫中的空间分辨性学习记忆能力产生明显损害，而对非空间学习、工作记忆则无明显影响。短时间SD(1 d)对大鼠学习记忆能力影响不大，随着SD时间的延长，其影响程度逐渐增加，尤其是4 d以后，潜伏期明显延长，游泳路程明显增加。表3睡眠剥夺大鼠Morris水迷宫测试穿越平台次数比较表4睡眠剥夺大鼠海马GFAP含量光密度值比较给大鼠腹腔注射丹红注射液在一定程度上能改善SD造成的学习记忆功能下降，使其游泳潜伏期和游泳路程缩短。这种保护作用在短时间SD(1 d)下表现不明显，随SD时间的延长逐渐增强，以3~4 d最为明显，这可能与中药起效慢、作用缓和、作用时间持久有关。随SD时间延长至5 d时，尽管实验组和对照组比较，差异仍有统计学意义，但两组的游泳潜伏期及游泳距离均延长至SD前的2倍左右，学习记忆能力已严重受损。由此看来，丹红注射液对睡眠剥夺大鼠学习记忆功能的保护作用有一定时限性，似乎以3~4 d效果较好。研究也显示，丹红注射液对正常大鼠(NS组)的学习记忆促进作用不明显。SPT中，与对照组相比，实验组各时间点的穿越平台次数略有增加，但差异无统计学意义，考虑这种增高可能是因为丹红注射液使大鼠的兴奋性增强，提高了其自发活动和探究行为。

　　星形胶质细胞(astrocyte，AS)占中枢神经细胞总数的40%~60%，而GFAP已成为AS活化的特异性标志。研究发现，AS不仅仅对神经元起支持填充作用，而且可以通过神经递质的释放与神经元进行对话，调节神经元功能，并在突触形成和突触可塑性中起重要作用[6, 7]。结果显示，大鼠经过SD后，实验组及对照组海马区内GFAP的表达均增强，且随着SD时间的延长逐渐增强，以5 d时最为明显。与对照组相比，实验组GFAP的表达明显增强。这种增强在短时间(1 d)SD下并不明显，SD 2 d后差异逐渐增大，并在3~4 d达到高峰。此外，我们还观察到，丹红注射液对学习记忆及GFAP表达的影响均在SD 2 d后开始明显，3~4 d达到高峰，这似乎在提醒我们丹红注射液对学习记忆功能的保护作用可能是通过海马中AS的活化实现的。丹红注射液的药理作用包括：①扩张血管，改善微循环;②通过抑制血小板聚集，防止血小板过度激活，起到抗凝及溶解血栓作用;③保护血管内皮;④促进血管再生;⑤防止兴奋性氨基酸对神经元的损伤。丹红注射液可能通过抑制神经元凋亡对神经元的损伤起到保护作用，其具体的保护机制可能与抑制NMDA受体兴奋后引发的钙超载或阻止Caspase的活化等有关[8]。有报道丹参酚酸可减轻大鼠脑水肿，改善大鼠的运动、记忆功能[9]，减轻感觉运动中枢及海马CA1区神经细胞损伤，并促进海马神经元的神经发生[10]。中药的具体药理作用机制较复杂，丹红注射液如何影响AS的活化、通过什么机制影响神经元功能，这可能是下一步研究需要探讨的问题。

【参考文献】
  　[1]Datta S, Mavanji V, Ulloor J, et al. Activation of phasic pontine-wave generator prevents rapid eye movement sleep deprivation-induced learning impairment in the rat: a mechanism for sleep-dependent plasticity[J]. J Neurosci,2004,24(6):1416.

　　[2]刘国龙, 赵明亮, 万子兵, 等. 睡眠剥夺对大鼠空间学习记忆的影响及其LTP机制的研究[J]. 第三军医大学学报,2006,28(6):569.

　　[3]Youngblood B D, Zhou J, Smagin G N, et al. Sleep deprivation by the "flower pot" technique and spatial reference memory.[J]. Physiol Behav,1997,61(2):249.

　　[4]李训军, 严家川, 潘峰, 等. REM睡眠剥夺对大鼠额叶皮质5-TH的含量及学习记忆的影响[J]. 重庆医学,2009,38(10):1151.

　　[5]邓芬, 胡长林, 谢运兰. 丹红注射液治疗大鼠急性脑梗死的实验研究[J]. 中西医结合心脑血管病杂志,2007,5(5):421.

　　[6]Hu R, Cai W Q, Wu X G, et al. Astrocyte-derived estrogen enhances synapse formation and synaptic transmission between cultured neonatal rat cortical neurons.[J]. Neuroscience,2007,144(4):1229.

　　[7]Wu J, Holstein J D, Upadhyay G, et al. Purinergic receptor-stimulated IP3-mediated Ca2+ release enhances neuroprotection by increasing astrocyte mitochondrial metabolism during aging.[J]. J Neurosci,2007,27(24):6510.

　　[8]吴旭青, 丁晶, 范薇. 丹红注射液对体外神经元N-甲基-D-天冬氨酸损伤后的保护作用[J]. 中国临床医学,2009,16(4):609.

　　[9]Du Gh, Qiu Y, Zhang J T. Salvianolic acid B protects the memory functions against transient cerebral ischemia in mice.[J]. J Asian Nat Prod Res,2000,2(2):145.

　　[10]Tang M, Feng W, Zhang Y, et al. Salvianolic acid B improves motor function after cerebral ischemia in rats.[J]. Behav Pharmacol,2006,17(5-6):493.