丹红注射液对睡眠剥夺大鼠学习记忆的影响
作者：司江华，杨金升，石向群，曲传勇，张明磊，王彦平，范磊
【摘要】 目的探讨丹红注射液(Danhong injection)对睡眠剥夺(sleep deprivation, SD)大鼠学习记忆及海马胶质纤维酸性蛋白(Glial Fibriliary Acidic Protein，GFAP)表达的影响。方法用小平台水环境法建立SD模型。选用Wistar大鼠，根据SD时间的不同(0～5 d)，随机分为6组，每组又分为实验组和对照组，实验组给予丹红注射液，相应时间点对各组大鼠行Morris水迷宫测试，免疫组化法检测海马组织中GFAP的含量。 结果①Morris水迷宫实验： 2，3，5 d组潜伏期，实验组低于对照组(P<0.05)，4 d组潜伏期，实验组低于对照组(P<0.01);2 ，5 d组游泳路程，实验组低于对照组(P<0.05)，3，4 d组游泳路程，实验组低于对照组(P<0.01);SD各时间点组穿越平台次数，实验组和对照组无统计学差异(P>0.05)。②海马GFAP含量：2 ，3 d组海马GFAP含量，实验组高于对照组(P<0.05)，4，5 d组海马GFAP含量，实验组高于对照组(P<0.01)。结论丹红注射液对SD后大鼠学习记忆的损害有保护作用，这种作用可能与海马中星形胶质细胞(astrocyte，AS)功能活化有关。
【关键词】 丹红注射液;睡眠剥夺;学习记忆;胶质纤维酸性蛋白;Morris水迷宫
Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of Danhong injection on cognitive function and the content of glial fibriliary acidic protein (GFAP) in hippocampus of Wistar rats during Sleep Deprivation(SD).MethodsSD was induced in Wistar rats by employing "flower pot" technique. The 72 rats were randomly divided into six groups according to the time of SD(0-5 d), and every group was also divided into two subgroups: experimental group and control group. The behaviors of rats were studied in Morris maze test at given time. Then immunohistochemistry was used to detect the level of GFAP in hippocampus. ResultsCompared with control groups, the escape latency and swimming distouce of experimental groups induced in 2,3,4,5 d(P<0.05) were decreased.There was no obvious difference in the times across plot between the experimental groups and control groups (P>0.05). Compared with control groups, the content of GFAP of experimental groups was increased on 2,3,4,5 d (P<0.05).ConclusionDanhong injection can improve the rat impairment of cognitive function induced by SD via the activation of astrocyt(AS) in hippocampus.
Key words： Danhong injection; Sleep deprivation; Cognitive function; Glial fibriliary acidic protein; Morris water maze
睡眠剥夺(sleep deprivation, SD) 是一种特殊的生理心理状态，可引起机体认知功能、情绪、行为及免疫功能等一系列改变[1]。既往有研究表明[2]，SD可影响动物的学习记忆能力。在战争环境下或特殊职业里，SD是不可避免的。因此，为了保证作业人员的安全与健康，保证作战和特殊职业工作的需要，探讨减少SD对机体影响的措施具有十分重要的意义。我们着眼于中药领域，采用动物行为学的方法，试图去了解丹红注射液(Danhong injection)对SD的对抗作用，并检测海马中胶质纤维酸性蛋白(Glial Fibriliary Acidic Protein，GFAP)的表达规律，以期阐明其可能机制。
1材料和方法
1.1动物及分组成年、健康Wistar大鼠，雌雄各半，体质量200～220 g，由甘肃省中医学院实验中心提供[合格号：SCXK(甘)2004-2006]。对连续3次120 s内未找到隐匿平台的的大鼠予以删除。根据SD时间的不同，72只大鼠随机分为正常睡眠(NS)、睡眠剥夺1，2，3，4，5 d等 6组;每组又分为实验组和对照组，每组6只。实验组以丹红注射液(菏泽步长制药有限公司惠赠)7.2 ml/kg腹腔注射给药，1次/d，连续7 d，对照组以同样方式给予等量生理盐水。
1.2睡眠剥夺模型的建立采用小平台水环境法(flower pot)建立大鼠SD模型。参照文献[3]制作大小为30 cm×30 cm×30 cm的鼠箱，中央放一直径为6.5 cm，高8 cm的平台。箱内注有水，水面低于平台2 cm，水温保持在20 ℃左右。大鼠可以在平台上自由摄取食物和水，但当进入快速眼动睡眠(rapid eye movement sleep, REM)时，由于骨骼肌的松弛使大鼠掉入水中而惊醒，如此反复多次造成REM的剥夺。在大鼠活动空间内给予12 h/12 h明暗交替，室内温度控制在18~22 ℃。
1.3水迷宫组成Morris水迷宫由北京硕林苑公司生产。包括一直径150 cm、高60 cm的圆形不锈钢水池，内壁黑色，置有直径15 cm、高25 cm的透明有机玻璃平台，以及水迷宫测试系统。实验时，平台隐藏在水下2 cm，水温保持在(22±0.5)℃。池壁上标有东南西北4个入水点，它们将水池划分为4个象限，在任意一象限区中间放置平台，平台没于水下2 cm。水池周围围有窗帘尽量消除外界影响，池壁水面上贴有不同颜色不同形状纸片。在实验过程中，保持环境安静。
1.4行为实验实验分为定位航行试验和空间探索试验两个部分。
1.4.1定位航行实验(place navigation test，PNT)每天08：00~11：00之间对每只大鼠进行训练，不选平台所在象限作为入水点，按顺时针方向把大鼠面向池壁放入水中，检测大鼠隐匿平台潜伏期。如果在规定的最长时间120 s内未到达平台，则由实验者将其引至平台，逃避潜伏期记为120 s，大鼠在平台休息20 s后进行下1次测试。观察并记录动物找到并爬上平台的潜伏期、游泳路程及游泳轨迹。3 d训练结束后将大鼠按组别放入睡眠剥夺箱。SD时间点到后进行最后1次PNT，记录平均潜伏期、平均游泳路程作为该只大鼠所得成绩。
1.4.2空间探索实验 (spatial probe test，SPT)各组大鼠最后1次PNT后撤除平台，将大鼠从最后1次入水点面向池壁放入水中，使大鼠在水迷宫中连续游泳，记录大鼠120 s内穿越原平台平面的次数。
1.5海马GFAP的测定各组大鼠最后1次水迷宫测试完后，在10%水合氯醛麻醉下用0.9%生理盐水200 ml经心脏快速灌注冲洗，再用4%多聚甲醛(用0.1 MPB配制，pH7.2~4.4)200 ml灌注取脑后固定。包埋，定位海马，冠状面切片，片厚3 μm;抗原热修复后依次加入3% H2O2、10%山羊血清封闭液，各在37 ℃温箱孵育10 min，加入1∶100 GFAP抗体，于4 ℃冰箱过夜，滴加二抗工作液及辣根酶，DAB显色，光镜下观察胞质呈棕黄色为阳性细胞。对照组染色步骤相同，阴性对照用PBS代替一抗。
1.6数据处理切片在统一放大倍数(10×40)下随机选5个视野，输入图像分析系统，以光密度值(Optical density)表示GFAP的含量，计算其均值。实验数据均采用SPSS16.0软件进行统计，进行单因素方差分析和组间t检验。
2结果
2.1睡眠剥夺大鼠Morris水迷宫测试各组大鼠SD后Morris水迷宫测试游泳潜伏期及路程均延长，实验组和对照组不同SD时间之间有统计学差异(P<0.01)，穿越平台次数下降不明显(P>0.05)。与对照组相比，实验组2，3 d及5 d组潜伏期缩短(P<0.05)，4 d组潜伏期缩短(P<0.01);实验组2 d及5 d组游泳路程缩短(P<0.05)，3 d及4 d组游泳路程缩短(P<0.01);实验组及对照组之间，穿越平台次数无明显变化(P>0.05)，差异无统计学意义(表1～3及图1~3)。表1睡眠剥夺大鼠Morris水迷宫测试潜伏期比较图1睡眠剥夺大鼠Morris水迷宫测试潜伏期比较表2睡眠剥夺大鼠Morris水迷宫测试路程比较
2.2睡眠剥夺大鼠海马组织GFAP的检测各组大鼠SD后海马中GFAP含量均增高，实验组和对照组不同SD时间之间有统计学差异(P<0.01)，形态学上表现为海马区GFAP阳性细胞增多，胞体变大，突起增粗增长。与对照组相比，实验组2 d及3 d组GFAP含量增高(P<0.05)，4 d及5 d组GFAP含量增高(P<0.01)，实验组和对照组之间有统计学差异(表4及图4)。