疏肝化湿汤防治2型糖尿病作用及抗细胞凋亡机制研究

                作者：周玉平，杨萍，邓棋卫 徐宜兵 张碧伦 曹耀兴 刘梅 万军

【摘要】  　　目的研究疏肝化湿汤对2型糖尿病的防治作用并探讨其抗细胞凋亡的作用机制。方法采用高糖高脂饲料喂养加腹腔注射链脲佐菌素建立动物模型，疏肝化湿汤干预后，采血检测血糖、血浆胰岛素，制作胰岛、心脏、肾脏组织切片，采用TUNEL法检测细胞凋亡，采用免疫组化法检测组织Bcl-2和Bax蛋白的表达。结果疏肝化湿汤能显著降低模型大鼠的血糖，升高其血浆胰岛素；能显著降低模型大鼠胰岛、心脏、肾脏组织的细胞凋亡，上调Bcl-2的表达，抑制Bax的表达。结论　疏肝化湿汤对2型糖尿病的防治作用可能与抑制胰岛β细胞凋亡有关；疏肝化湿汤还能抑制心肾组织的细胞凋亡，这可能是其防治并发症的原因之一。

【关键词】  疏肝化湿汤； 2型糖尿病； 细胞凋亡

　　随着社会的发展，人们饮食结构和生活方式的改变，糖尿病的患病率在全球范围内逐年增长［1］。本课题组根据当前临床2型糖尿病（T2DM）的特点，提出肝郁湿阻也是T2DM的主要病机［2］，并经长期临床总结创立验方疏肝化湿汤用于临床，取得了良好效果［3］。本研究旨在从动物实验角度研究疏肝化湿汤对T2DM及其并发症的防治作用并探讨其作用机制是否与抑制有关脏器组织的细胞凋亡有关,并初步研究其抗凋亡的分子机制。

　　1  材料
   
　　60只雄性Wistar大鼠适应性饲养1周，随机抽出10只为正常对照组，喂以普通饲料。余大鼠喂以高糖高脂饲料(组成：10％猪油，20％蔗糖，2.5％胆固醇，1％胆酸盐，66.5％常规饲料)4周，再按30 mg/kg的剂量一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ，溶于0.1 mol／L柠檬酸缓冲液，pH4.5)。正常对照组在相同时间腹腔注射同等剂量的柠檬酸缓冲液作为对照。

　　2  方法

　　2.1  实验分组与药物干预疏肝化湿汤组成为柴胡、苍术、鬼箭羽各12 g，黄连6 g，白芍、白术、当归、茯苓、泽泻、川芎、玉米须各10 g，葛根、黄芪、荔枝核各15 g。以上中药常规煎煮两次，将两次水煎液混合，并水浴浓缩为2.8 g生药/ml，1.4 g生药/ml的两种高低浓度的药液，大鼠灌胃剂量按人与大鼠体表面积换算方法计算。
   
　　60只Wistar大鼠适应性饲养1周后，随机抽出10只作为正常对照组（A组），将剩余50只大鼠进行T2DM造模。将造模大鼠随机平均分为模型组（B组）、疏肝化湿汤高剂量预防组（C组）、疏肝化湿汤低剂量预防组（D组）、疏肝化湿汤高剂量治疗组（E组）、疏肝化湿汤低剂量治疗组（F组）。其中，C组和D组分别从造模第1天即开始预先给予疏肝化湿汤高、低剂量干预，每日两次灌服疏肝化湿汤，每次2 ml/100 g（体质量），连续灌胃5周。E组、F组在造模结束后分别予疏肝化湿汤高、低剂量干预，每日两次灌服疏肝化湿汤，每次2 ml/100 g（体质量），连续灌胃1周。正常对照组和模型组灌服等剂量的生理盐水。

　　2.2  标本收集所有大鼠造模结束后一周进行标本采集。禁食12h后进行打开腹腔手术，腹主动脉取血，分离血浆冰箱保存备用，用于检测血糖、血浆胰岛素。迅速分离胰岛、心脏、肾脏组织，冰盐水冲洗后放入福尔马林固定液中固定，制作石蜡切片，片厚5 μm，用于检测各组织细胞凋亡和Bcl-2、Bax蛋白的表达。

　　2.3  指标检测

　　2.3.1  细胞凋亡的检测采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)，具体步骤参照试剂盒说明书。在每张玻片上于400倍镜下随机取5个视野，数出每个视野阳性细胞数及总的细胞数，以此计算细胞凋亡指数(AI)，AI＝（阳性细胞数/总的细胞数）×100％。

　　2.3.2  Bax，Bcl-2蛋白的检测采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(SP)的免疫组织化学法。具体方法参照SP免疫组化试剂盒说明书。结束时显微镜观察并照相，用image pro plus5.0病理图像分析软件测定每张照片的阳性表达区域的平均积分光密度IOD，以随机选取的几个视野的IOD均值作为其表达水平。

　　2.4  统计方法实验数据均以±s表示，进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，在此基础上进一步用最小显著差法(LSD)做均数间的两两比较。检验显著性水准α＝0.05。

　　3  结果

　　3.1  疏肝化湿汤对2型糖尿病大鼠模型血糖、血浆胰岛素的影响见表1。实验结果表明血糖和血浆胰岛素在各组之间有显著差异（P<0.001）。与正常组相比，模型组血糖显著升高（P<0.05），血浆胰岛素则显著下降（P<0.05）。与模型组相比，疏肝化湿高、低剂量预防组的血糖值显著下降（P<0.05），血浆胰岛素显著升高（P<0.05）；与模型组相比，疏肝化湿汤高剂量治疗组的血糖值显著下降（P<0.05），高、低剂量组血浆胰岛素均显著升高（P<0.05）。由此可见，疏肝化湿汤对2型糖尿病模型具有良好的预防和治疗作用。表1  疏肝化湿汤对2型糖尿病大鼠模型血糖、血浆胰岛素的影响（略）

　　3.2  疏肝化湿汤对2型糖尿病大鼠模型靶器官组织细胞凋亡的影响结果见表2～4。实验结果表明胰岛β细胞、心脏、肾脏组织细胞凋亡率、Bax、Bcl-2在各组之间有显著差异（P<0.001）。与正常组相比，模型组凋亡率、Bax表达显著升高（P<0.05），Bcl-2则显著下降（P<0.05）。与模型组相比，疏肝化湿汤高、低剂量预防组的凋亡率、Bax表达显著下降（P<0.05），Bcl-2显著升高（P<0.05）；与模型组相比，疏肝化湿汤高、低剂量治疗组的凋亡率、 Bax表达显著下降（P<0.05），Bcl-2显著升高（P<0.05）。由此可见，疏肝化湿汤能明显抑制2型糖尿病大鼠模型胰岛β细胞、心脏、肾脏组织的细胞凋亡，其机理可能与下调其促凋亡基因Bax及上调基因Bcl-2的的表达有关。表2  疏肝化湿汤对2型糖尿病大鼠胰岛β细胞凋亡的影响，表3  疏肝化湿汤对2型糖尿病大鼠心肌组织细胞凋亡的影响，表4  疏肝化湿汤对2型糖尿病大鼠肾脏组织细胞凋亡的影响（略）