桦褐孔菌影响糖尿病豚鼠糖代谢机理的实验研究

               作者：李天洙，李香俊，金香子，张学武

【摘要】  目的通过观察桦褐孔菌水提取物对糖尿病豚鼠的体质量、饮水量，空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbA1c)等生化指标及对葡萄糖激酶(GK)表达的影响，初步探讨桦褐孔菌影响糖尿病豚鼠糖代谢的机理。方法选用成年雄性豚鼠48只，每组8只：正常组，桦褐孔菌小剂量组、中剂量组、大剂量组，阴性对照组及阳性对照组。链脲佐菌素(STZ)腹腔注射制作豚鼠糖尿病模型，灌胃桦褐孔菌水提取物，观察体质量和饮水量的变化，治疗8周后，心脏取血测定FBG、HbA1c，取肝脏，用Western blot测定葡萄糖激酶的表达。结果桦褐孔菌治疗组饮水量显著减少，体质量增加较明显，FBG和HbA1c水平明显下降，葡萄糖激酶的表达增高明显，并且表现为剂量梯度依赖。结论桦褐孔菌对糖尿病豚鼠饮水量的改善、体质量的增加、降低血糖及降低血红蛋白的糖基化程度具有较明显的效果,可能和通过增强葡萄糖激酶的表达，进而加强葡萄糖的分解代谢过程有关。

【关键词】  桦褐孔菌; 糖尿病豚鼠; 血糖; 葡萄糖分解代谢

　桦褐孔菌Inonotus obliquus Chaga别名白桦茸，主要分布于北纬45～50°的地区，在我国主要分布在黑龙江和吉林省长白山地区，民间广泛利用其防治癌症等多种疑难杂症[1]。近年来，国内外学者研究发现桦褐孔菌含有三萜类、类固醇、甾醇类、多糖类、木质素类、黑色素类、多酚类、鞘氨脂类似物、甘露醇、半单宁化合物、栓菌酸、生物碱、叶酸衍生物以及芳香物质等多种化学成分。目前，美国、日本、俄罗斯、波兰等国外研究机构应用桦褐孔菌提取物治疗糖尿病已成为热点，但此项研究国内报道较少。本实验通过测定糖尿病豚鼠饮水量、体质量、FBG和HbA1c等指标变化及葡萄糖激酶的表达，初步探讨桦褐孔菌对糖尿病豚鼠降低血糖生物化学及分子生物学机制，为桦褐孔菌的临床应用提供理论依据。

　　1 材料

　　1.1 动物Hartley雄性豚鼠80只，体质量400～500g,由延边大学医学部实验动物科提供。

　　1.2 用药桦褐孔菌水提取物，由延边圣林菌业有限公司提供。

　　1.3 试剂STZ(美国Sigma公司)，蛋白质提取纯化试剂盒(Bioss p1250)，GK单克隆抗体 (Santa Cruz,USA);其他试剂均应用国产优级纯试剂。

　　1.4 仪器全自动生化分析仪(日立7600)，糖化血红蛋白分析仪(Sysmex GT)，电泳装置(Bio-rad)。

　　2 方法

　　2.1 制作糖尿病动物模型实验动物适应性喂养1周后,禁食不禁水12 h,一次性腹腔注射STZ 80 mg/kg(临用前用pH 4.5的柠檬酸缓冲液溶解,配成浓度为1%混合液,30 min内注射完),第7天禁食不禁水12 h,用乙醚麻醉后取眦静脉血,离心后取血清测FBG,取FBG≥8.83 mmol/L者作为糖尿病成模标准[2]。

　　2.2 实验分组及药物处理取造模成功的糖尿病豚鼠48只(本实验造模成功54只)，按血糖和体质量随机分为阴性对照组(模型组)、桦褐孔菌小剂量组、中剂量组、大剂量组及阳性对照组(盐酸二甲双胍治疗组)，每组各8只，桦褐孔菌小剂量组、中剂量组、大剂量组分别灌胃桦褐孔菌提取物300，600，900 mg/kg。阳性对照组灌胃盐酸二甲双胍200 mg/kg，正常对照组和糖尿病模型组每天灌胃相同剂量的蒸馏水1次,连续8周。实验期间饲以标准饲料、自由饮水及新鲜蔬菜。

　　2.3 实验观察及生化指标测量监测各组饮水量，每天测量饮水量，每隔7 d测量体质量。实验8周后，各组禁食不禁水12 h，麻醉后心脏取血测量生化指标 (FBG，HbA1c)。

　　2.4 Western blot实验8周后，取豚鼠肝脏，利用蛋白质提取纯化试剂盒提取总蛋白质。提取的蛋白质进行10% SDS-PAGE电泳，每孔点样30 μl蛋白提取液(含30 μg总蛋白)，然后将电泳分离的蛋白质转移到PVDF膜上(4°C恒压100v，1.5 h)。用牛奶封闭室温1h后，用TBST清洗3次,5 min/次。加入1：1 000稀释的羊抗豚鼠GK单克隆抗体室温培育1h，再加入1∶200稀释的兔抗羊IgG二抗培育2h。取出膜后，TBST充分冲洗3次, 15 min/次。压片后加入ECL显色液，置于UVP图像成像仪中观察并分析结果。条件设置为曝光1，2，4 min，CCD自动获取图像。以β-actin作为内参对照。

　　2.5 统计分析数据以±s表示，实验前后数据比较采用t检验，各组间进行单因素方差分析。实验数据处理均用SPSS16.0统计软件进行统计分析。