鹿角脱盘蛋白的提取工艺研究

　　2.2 不同浸提料液比对蛋白提取效果的影响精密称取鹿角脱盘粉4份，每份300 mg。加入pH12的缓冲溶液浸提，料液比(W/V)分别为1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，时间为3 h，浸提次数为两次，提取温度4℃，6 000r·min-1离心15 min，上清液合并，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果见图2由图2可知，料液比为1∶5和1∶10时提取出的鹿角脱盘蛋白条带最多，但差别并不明显，因此在浸提过程中选择料液比为1∶5。

　　2.3 不同浸提时间对蛋白提取效果的影响精密称取鹿角脱盘粉5份，每份300 mg。加入pH12的缓冲溶液浸提，料液比1∶5，时间依次为3，6，8，12，24 h，时间为3 h，浸提次数为两次，提取温度4℃，6 000 r·min-1离心15 min，上清液合并，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果见图3。从左至右样品顺序依次为：Marker、pH3、pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9、pH10、pH11、pH12Marker分子量自上而下依次为：97.4 ，66.2，43.0，31.0，20.1，14.4 kDa

　　图1 不同浸提pH值对蛋白提取效果的影响从左至右样品顺序依次为：Marker、料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20Marker分子量自上而下依次为：97.4 ，66.2，43.0，31.0，20.1，14.4 kDa

　　图2 不同浸提料液比对蛋白提取效果的影响从左至右样品顺序依次为：Marker、3、6、8、12、24 hMarker分子量自上而下依次为：97.4 ，66.2，43.0，31.0，20.1，14.4 kDa

　　图3 不同浸提时间对蛋白提取效果的影响由图3可知，浸提时间长短对提取出的鹿角脱盘蛋白条带影响很小，因此在浸提过程中选择浸提时间为3 h。

　　2.4 不同浸提盐浓度对蛋白提取效果的影响精密称取鹿角脱盘粉10份，每份300 mg。其中5份依次加入含EDTA 10，20，30，40，50 mmol/L的pH12的缓冲溶液浸提，另5份依次加入含NaCl 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mol/L的pH12的缓冲溶液浸提，料液比为1∶5，时间为3 h，浸提次数为两次，提取温度4℃，6 000 r·min-1离心15 min，上清液合并，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，结果见图4由图4可知，随着EDTA浓度的增加，提取出的鹿角脱盘蛋白条带也越来越多，当达到50 mmol/L时提取效果最好，因此确定浸提时EDTA的浓度为50 mmol/L;随着NaCl浓度的增加，提取出的鹿角脱盘蛋白条带也越来越多，当达到0.5 mol/L时提取效果最好，因此确定浸提时NaCl的浓度为0.5 mol/L。

　　综上所述，鹿角脱盘蛋白的提取工艺确定为：pH值12的缓冲液(含50 mmol/L EDTA、0.5 M NaCl)浸提，料液比为1∶5，浸提时间为3 h，浸提次数2次。

　　2.5 验证试验称取鹿角脱盘粉3份，每份5 g，按上述工艺进行提取，经80%硫酸铵沉淀，透析后冻干，采用Bradford法测定蛋白含量，收率及纯度见表1表1 验证实验中蛋白的收率及纯度%

　　3 讨论

　　近年来，随着人们生活水平的提高和大众健康、保健意识的增强，对鹿角盘的化学成分、功能评价、药理作用等进行了一定的研究[2～4]。由于鹿角脱盘是鹿茸骨化后的产物，含有大量钙磷等化合物，构成了坚硬的结构，使得包含其中的蛋白等有效成分难以分离提取，直接影响了人们对它的研究。本实验考察了不同pH值、不同盐浓度、不同料液比等影响因素对鹿角脱盘蛋白提取效果的影响，确定了鹿角脱盘蛋白的提取工艺。由实验结果可以看出，当浸提缓冲溶液的pH为碱性时，鹿角脱盘蛋白的提取效果最高，由此证明鹿角脱盘中含有大量的酸性蛋白，因此在碱性条件下更易溶出。随着EDTA浓度的增加，蛋白的提取效果也随之增加，主要原因是由于鹿角脱盘为骨化组织，含有大量的钙离子，与蛋白质结合从而限制其溶解，加入EDTA可以络合钙离子，从而使蛋白释放溶解。在蛋白质水溶液中，加入少量的中性盐，如硫酸钠、氯化钠等，会增加蛋白质分子表面的电荷，增强蛋白质分子与水分子的作用，从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大，实验结果表明鹿角脱盘蛋白需在较高的盐浓度下才可溶解。

【参考文献】
  　[1] 国家药典委员会. 中国药典，Ⅰ部[S]. 北京:化学工业出版社,2005 :225.

　　[2] 张宝香，金春爱，赵延平. 鹿角盘的化学成分与开发利用[J]. 特种经济动植物,2005,12:7.

　　[3] 王丽虹，高志光. 鹿花盘水溶性成分的药理活性与临床应用[J]. 经济动物学报，1999，3(3)：18.

　　[4] 陈玉山，王振玉，王本祥. 鹿角脱盘注射液治疗乳腺增生的药理实验研究[J].生化药物杂志,1987,2:12.