猪脑提取物对阿尔茨海默病大鼠学习记忆的保护作用

            作者：李永金，张鹤云，封云，陈素仙，张太平，陆任云，陈月芳，黄晓佳

【摘要】  目的观察猪脑提取物对痴呆大鼠学习记忆的影响，并探讨其作用机制。方法海马CA1区微量注射喹啉酸造成Alzheimer病(AD)大鼠。将大鼠随机分成假损伤组、对照组、猪脑提取物组、猪脑提取物预防给药组及阳性药脑活素组。肌肉注射给药，连续给药30 d。采用Y-迷宫和被动回避性跳台法测定大鼠的学习记忆水平;分光光度法测定大脑皮质MDA的含量，及海马的NO的含量和NOS的活性。结果与对照组大鼠相比，给予猪脑提取物第10，20，30天后，大鼠迷宫、跳台的错误次数明显减少;给药30 d后，大鼠大脑皮质MDA，海马NO含量和NOS活性明显降低。结论猪脑提取物可提高痴呆大鼠学习记忆能力，其作用机制与其降低大鼠脑内的MDA、NO、NOS有关。

【关键词】  猪脑提取物; 阿尔茨海默病; 学习记忆

　阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease，AD)是一种与年龄高度相关的，以进行性学习记忆、认知功能减退为主要临床症状，以老年斑、神经元纤维缠结、神经元丢失为主要病理改变的中枢神经系统退行性疾病，其发病机制目前尚不清楚[1]。在发达国家AD已成为继心脏病、癌症、中风之后人类疾病第4位的死因，因此积极开展对AD的研究具有重要意义。

　　动物脑提取物含有小分子肽、神经生长因子等多种活性成分，可用于治疗AD等一些脑功能性疾病[2～4]，目前已有众多的脑提取物产品进入临床，国外生产的脑活素已被广泛应用于阿尔茨海默病、脑中风、脑震荡、脑损伤的治疗，取得了一定的疗效。我们利用新生猪脑制备猪脑提取物，并对其进行药效和机制的初步探讨。

　　1 材料与仪器

　　1.1 动物雄性Wistar大鼠，体质量(280±25)g，由江苏大学实验动物中心提供。

　　1.2 试剂喹啉酸(quinolinic acid，QA)系Sigma化学公司产品;脑活素由南京金康制药有限公司提供(批号：000110);丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)测定试剂盒为南京建成生物工程研究所产品;其余为国产分析纯。

　　1.3 仪器江湾Ⅰ型C脑立体定位仪，为第二军医大学产品;MG-2迷宫刺激器,江苏省张家港市生物医学仪器厂产品;大鼠跳台由中国医学科学院药物研究所研制;721分光光度计，上海第三分析仪器厂产品。Super T21型高速冷冻离心机，美国杜邦公司产品。

　　2 方法

　　2.1 猪脑提取物制备称取一定量新生猪脑组织，去脂肪以1∶2比例加入去离子水，匀浆打碎，反复冻融3～4次使细胞破碎，4℃ 8 000 r/min离心15 min，取上清用截至分子量1万的超滤膜超滤，获得分子量1万以下的组份，冻干浓缩，即为有活性的猪脑提取物[4]。

　　2.2 分组与给药将大鼠随机分成假损伤组、模型对照组、猪脑提取物组、猪脑提取物预防给药组(0.15 mg·kg-1)及阳性药脑活素组(4 mg·kg-1)。其中按猪脑提取物剂量分成高(0.75 mg·kg-1)、中(0.15 mg·kg-1)、低(0.03 mg·kg-1)剂量组。共7组，每组13只，肌肉注射给药，连续给药30 d;假损伤组及模型对照组给生理盐水，其中预防给药组术前给药7 d。

　　2.3 损毁海马Glu神经元的AD动物模型制备依据文献方法[5，6]，对双侧海马CA1区立体定位后，将用0.01 mol·L-1 PBS缓冲液溶解的QA 2 μl(含150 nmol)缓慢注入海马CA1区，假损伤组注入同等体积PBS。每侧注入时间为5 min，留针5 min，起针局部消毒后缝合皮肤。术后连续3 d肌注青霉素防止感染。

　　2.4 Y-迷宫分辨学习能力检测依据文献方法[5，6]，将大鼠置于迷路箱的任一支臂中，适应5 min，在灯亮5 s时，给于电刺激(70 V、延迟5 s)直至大鼠最终逃避到安全区后10 s，作为1次测验。凡大鼠受电击能从起步区逃至有灯光信号的安全区为正确反应，否则为错误反应。每次训练后休息30 s，每天训练10次，记录错误次数A/10，作为学习成绩。24 h后重复以上试验，记录上述指标，作为记忆成绩。分别于术前、术后10，20，30 d进行测试，均于下午14:00～17:00进行。

　　2.5 被动回避性跳台试验各组动物给药后1 h进行被动回避性跳台试验[7]。将大鼠放入实验箱内，适应5 min后，通以36 V交流电以大鼠从台上跳下双足接触电珊遭到电击为错误反应，记录3 min内出现错误的次数，训练后24 h进行测验，记录3 min内出现错误的次数作为记忆成绩。分别于术前、术后10，20，30 d进行测试，均于上午8:00～11:00进行。

　　2.6 生化指标MDA、NO、NOS的检测快速断头取海马组织及大脑皮质，称重，按1∶10(W/V)加入预冷的匀浆介质(0.01 mol·L-1蔗糖，0.01 mol·L-1 Tris-HCl，0.000 1 mol·L-1EDTA-2Na溶液，pH7.4)，冰浴匀浆5 min;以2 000 r/min离心10 min，取上清4°C 13 000 r/min离心18 min，取海马上清液检测NO含量和NOS活性;取大脑皮质上清液检测MDA的含量。MDA，NO，NOS的测定方法按其各自分析试剂盒操作要求进行。样品蛋白定量采用改良Lowry法测定。

　　2.7 统计分析实验数据采用统计软件SPSS11.0进行单因素方差分析，实验结果采用±s表示，P<0.05为组间有显著差异，P<0.01为组间有极显著差异。

　　3 结果

　　3.1 Y-迷宫分辨学习能力检测实验各组手术前和手术后不同阶段迷宫试验学习记忆成绩见表1~2。对照组与假损伤组相比，其训练及测验的错误的次数明显高于假损伤组，学习记忆成绩差异显著(P<0.01)，说明海马CA1区注射喹啉酸可形成痴呆模型。中剂量组、及预防给药组大鼠给药10，20，30 d后，其训练及测验的错误的次数低于模型对照组(P<0.05或P<0.01)。

　　3.2 被动回避性跳台试验各组大鼠手术前和手术后被动回避性跳台实验结果见表3～4。术后对照组大鼠与假损伤组大鼠相比，其训练及测验的错误的次数明显高于假损伤组(P<0.05或P<0.01)。给药10 d后，多数组与模型对照组相比有统计学差异;给药20，30 d给药各组均能提高痴呆大鼠记忆能力，与模型对照组相比差异显著(P<0.05或P<0.01)，有一定的剂量依赖性。预防给药组疗效较好。表1 猪脑提取物对痴呆大鼠Y-迷宫分辨学习的影响　表2 猪脑提取物对痴呆大鼠Y-迷宫分辨学习的影响　表3 猪脑提取物对痴呆大鼠被动回避性跳台实验的影响表4 猪脑提取物对痴呆大鼠被动回避性跳台实验的影响　　3.3 生化指标MDA、NO、NOS的检测各组大鼠大脑皮质MDA，海马的NO、NOS的测定结果见表5。对照组大鼠与假损伤组大鼠相比，MDA、NO、NOS显著增高(P<0.05或P<0.01)，猪脑提取物能剂量依赖性降低痴呆大鼠大脑皮质MDA，海马NO含量和NOS活性(P<0.05或P<0.01)表5 猪脑提取物对痴呆大鼠大脑皮质MDA、海马NO含量及NOS活性的作用