壁虎醇提物对小鼠肾包膜下移植S180肉瘤的抑制作用

            作者：宋佳玉，王建刚，张清伟，王晓兰，段冷昕，李艳

【摘要】  目的观察壁虎醇提物对小鼠肾包膜下移植S180肉瘤的作用并探讨机制。方法建立免疫功能正常小鼠肾囊膜下移植S180肉瘤模型，将40只雄鼠随机分为阴性对照生理盐水组、阳性对照环磷酰胺组(0.1 g·kg-1)、壁虎醇提物高剂量组(2.4 g·kg-1)、壁虎醇提物低剂量组(1.2 g·kg-1)共4组。腹腔注射给药6 d后,杀鼠称量荷瘤小鼠体重，评价药物对小鼠毒性;测量小鼠肉瘤体积，称取移植瘤小鼠胸腺重、脾脏重，计算抑瘤率、胸腺指数、脾脏指数;用SABC免疫组化法检测血管内皮生长因子(VEGF)的表达。结果壁虎醇提物可抑制小鼠肉瘤S180生长,环磷酰胺组、壁虎醇提物高剂量组、壁虎醇提物低剂量组抑瘤率分别为74.5%，77.5%，57.5%，且各组末体重/初体重分别为0.94，1.03，0.99;壁虎醇提物对免疫器官无影响，而环磷酰胺组胸腺指数、脾脏指数与阴性对照组比则有明显的统计学差异(P<0.05);免疫组化显示环磷酰胺组、壁虎醇提物组与生理盐水组比较VEGF蛋白的表达明显减少。结论壁虎醇提物有抗肿瘤活性,其抗肿瘤的部分作用可能通过抑制肿瘤血管的生成而实现 。

【关键词】  壁虎醇提物; 血管内皮生长因子; 肾包膜; S180肉瘤

　　壁虎又称为守宫、天龙等，为壁虎科动物无蹼壁虎Gecko swinhoana Gunther或其他几种壁虎除去内脏的全体，是传统的咸寒软坚中药，具有祛风、定惊、散结、解毒的功效。大量研究报道壁虎有显著的抗肿瘤作用。本课题组前期实验也证实中药壁虎对食管癌细胞和S180荷瘤小鼠具有确切的抑制作用[1～3]。但壁虎成分十分复杂，究竟是何种成分发挥抗肿瘤作用，目前还不清楚，本课题组从干壁虎中提取得到壁虎醇提物，发现该醇提物可以抑制小鼠肾包膜下移植S180肉瘤生长。

　　1 材料与仪器

　　1.1 壁虎醇提物的制备及试剂加工过程：干无蹼壁虎1 000 g粉碎为粗粉，置于4 000 ml Tris-HCl缓冲液中(pH=7.4)，浸泡过夜，超声细胞破碎，11 000 r·min-1离心，取上清，加无水乙醇至终浓度为55%，放4℃冰箱中，每20~30 min搅拌1次，4 h后11 000 r·min-1离心，取上清，真空旋转蒸发回收乙醇，最终冷冻干燥。环磷酰胺注射液(江苏恒瑞医药有限公司)。含15%胎牛血清RPMI-1640 培养液。VEGF免疫组化染色试剂盒(福州迈新生物科技开发有限公司)。

　　1.2 动物及瘤株试验所用昆明种小鼠由河南科技大学实验动物中心提供(合格证:0001350 )，体质量(26±3) g,均为雄鼠。S180腹水小鼠由河南省医科所提供。

　　1.3 仪器游标卡尺(广西桂林量具刃具厂);高速冷冻离心机(江苏省太仓市华美生化仪器厂);万分之一电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司);冷冻干燥仪(德国MARTIN CHRIST公司);旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器公司)。

　　2 方法

　　2.1 肾包膜下移植S180肉瘤模型建立将S180腹水小鼠抽出腹腔积液离心洗2 次,用无菌生理盐水液稀释成1 ×107 个/ ml的肉瘤细胞悬液。在小鼠右前腋下接种0. 2 ml肉瘤细胞悬液。7 d后，杀鼠取瘤。将腋下接种的S180肉瘤标本, 于超净工作台剪成0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm 大小之瘤块, 置于含10%胎牛血清的RPMI1640 培养液中,冰浴存放备用。小鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠，按0.2 ml/100 g动物体重麻醉小鼠。小鼠取俯卧位,常规消毒后从右侧肾脏部位平行脊椎切开一约1 cm 的切口,托出肾脏。以眼科镊轻提肾囊膜,以自制接种器将S180肉瘤组织小块接种于肾囊膜下。还纳肾脏于体内,分层缝合肌层及皮肤层。

　　2.2 壁虎醇提物对荷瘤小鼠S180移植瘤的抑制作用观察将40只动物随机分成4组，生理盐水对照组、CTX组、壁虎醇提物高(2. 4 g/kg)、低(1.2 g/kg) 剂量组共4组,每组各10只,根据体重按0.1 ml/10 g自术后开始腹腔注射，CTX组第1天注射1次，其余组均1 d/次，给药6 d后,称鼠重，处死小鼠,打开腹腔, 以游标卡尺测量瘤体长径(a)与宽径(b), 计算瘤体大小(TS)，瘤块生长的△TS值和抑制率：TS= ab2/ 2 △TS= 末体积 - 初体积抑制率( %) = (1- 用药组瘤体变化/ 对照组瘤体变化) ×100%

　　2.3 药物毒性观察以小鼠被处死前的体重(FBW) 与给药前的体重(IBW) 之比值作为判定药物对荷瘤小鼠毒性的指标。FBW/IBW≥0.80, 则认为所测药物毒性较小。

　　2.4 壁虎醇提物对荷瘤小鼠免疫器官的影响 按上述方法给药6 d后，处死动物取胸腺，脾脏称重。胸腺指数=胸腺重/体质量，脾脏指数=脾脏重/体质量。

　　2.5 小鼠S180肉瘤组织病理学变化肿瘤组织用10%中性甲醛固定,石蜡包埋切片,常规HE染色,光镜观察肉瘤组织病理变化。

　　2.6 VEGF蛋白表达的检测用SABC免疫组化法,操作步骤按照试剂盒说明书进行。VEGF判定与分析：凡细胞浆、细胞膜出现棕黄色颗粒或均质样棕黄色结构者为VEGF免疫反应阳性细胞。免疫组化染色评分标准是：根据着色细胞的比例(染色范围)及染色强度，染色范围(阳性细胞比率)分为0～4级，阴性为0分;阳性细胞1%～25%为1分;25%～50%为2分;51%～75%为3分;76%～100%为4分。染色强度划分为0～3级,阴性为0分;弱阳性为1分;中等强度为2分;强阳性为3分;两者得分相加为最后得分。

　　2.7 统计方法运用SPSS 统计软件，采用单测t检验。