HPLC测定结核灵片中狼毒乙素的含量
【摘要】 目的 建立测定结核灵片中狼毒乙素含量的方法。方法 采用高效液相色谱法，色谱柱为Agilent HCC18,流动相为甲醇水（体积比70∶30），流速1.0 mL/min，检测波长291 nm，柱温为室温。结果 狼毒乙素质量浓度在0.606～ 7.278 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，r=0.999 8；平均回收率为100.20%，RSD为0.29%（n=6）。结论 本方法简便、准确，可用于测定结核灵片中狼毒乙素的含量。
【关键词】 结核灵片 狼毒乙素 HPLC
结核灵片收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第十三册中，由狼毒药材（大戟科植物月腺大戟Euphorbia ebracteolata Hayata 及狼毒大戟Euphorbia fischeriana Steud.的根）经煎煮提纯而成，主治淋巴结核，对肺结核及其他淋巴结核亦有疗效［1］。该标准采用紫外分光光度法测定结核灵片中的狼毒乙素含量。本文建立了高效液相色谱法的外标法，结果表明本文方法简便、准确、可靠，可作为该制剂的含量测定方法。
1 仪器与试药
SHIMADZU岛津LC2010A高效液相色谱仪，CLASSVP色谱数据工作站；SartoriusBP211D电子分析天平；JL180DTH超声波清洗器。
结核灵片（江门市恒健药业有限公司提供，批号：070701、071101、080201、080501、080801、081001）。狼毒乙素对照品（由江西万基药物研究院有限责任公司提供，纯度≥99.9%，批号：461130601）；甲醇（天津四友，色谱纯）；水为双蒸馏水（自制），其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 供试品溶液的制备
取结核灵片20片，精密称定总质量，求得平均片质量，研细至粉末，取约1 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加水5 mL，振摇使成稠膏，加入甲醇35 mL，摇匀，超声20 min，取出，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液,即得。
2.2 阴性样品的制备
用密度为1.32～1.36(60～65 ℃)的淀粉浆代替清膏，按结核灵片的生产工艺及供试品溶液的制备方法制备，即得。
2.3 对照品溶液的制备
精密称取狼毒乙素对照品0.012 13 g，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为狼毒乙素对照品储备液（121.3 μg/mL）。再精密量取2 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为狼毒乙素对照品溶液（2.426 μg/mL）。
2.4 色谱条件
色谱柱为Agilent HCC18（4.6 mm×250 mm，5 μm，安捷科技公司）；柱温室温；流动相为甲醇水（体积比70∶30）；流速为1.0 mL/min；检测波长为291 nm，进样量为20 μL；在该色谱条件下，理论板数按狼毒乙素计算大于2 000，狼毒乙素与杂质峰可达基线分离，分离度大于1.5。色谱图见图1。
2.5 标准曲线的绘制
分别精密吸取上述对照品储备液（121.3 μg/mL）0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 mL，分别置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制得质量浓度为0.606、1.213、2.426、4.852、7.278 μg/mL的系列溶液。分别精密吸取20 μL进样，按上述色谱条件测定，记录色谱图。以狼毒乙素质量浓度（ρ）为横坐标，狼毒乙素峰面积（A）为纵坐标作图，得回归方程：A=158577ρ-5459.2,r=0.999 8(n=5)。结果表明狼毒乙素质量浓度在0.606～7.278 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。
2.6 重复性试验
取同一批结核灵片(批号070701)，按“2.1”项下制备方法平行制备6份供试品溶液，分别依法进样，测得峰面积并计算含量，结果测得平均含量为0.01439%，RSD为0.34%。
2.7 稳定性试验
取供试品溶液20 μL，分别在0、2、5、7、10、12 h进样，共测5次，结果测得狼毒乙素含量的RSD值为0.31%，表明供试品溶液在12 h内测定稳定。