SMART技术构建红曲霉全长cDNA文库
1.2.4 原始文库质量鉴定
取适量原始文库菌液，均匀地涂在含30 μg/mL氯霉素的LB平板上，随机挑取15个克隆，提取质粒经SfiⅠ酶切后电泳检测，可测定其重组率及重组片段的大小。文库的扩增采用涂平板培养扩增。取适量原始文库均匀地涂在10个含30 μg/mL氯霉素的LB平板，37 ℃倒置培养过夜，用含有25%(φ)甘油LB培养基洗脱所有的菌落，2 mL/板，将每板的洗脱液混合摇匀即得到了扩增文库，检测其滴度，分装，放置-80 ℃保存。
2 结果分析
2.1 总RNA提取
提取的样品总RNA经紫外分光光度计测定，A260/A280值为1.77，表明所得总RNA纯度较高，但稍有降解。1.1%琼脂糖凝胶电泳结果显示(图1)，28 S rRNA、18 S rRNA和5.8 S rRNA三条特征条带清晰，表明总RNA比较完整，也没有明显的基因组DNA污染。
2.2 双链cDNA的合成及分级
合成的双链cDNA产物的1.1%琼脂糖凝胶电泳结果显示，成一弥散带，最大片段超过10 kb，主要集中在0.5～2.5 kb (图2 )，表明合成的cDNA是比较完整的。由于较小的非全长cDNA片断更容易连接进载体，所以需要对经过蛋白酶K处理和SfiⅠ酶切后的cDNA进行分级分离，以去除较小的cDNA片断和引物片断。采用CHROMA SPIN400柱分级分离，共收集15管洗脱液(图3 )。根据1.1%脂糖凝胶电泳检测结果，合并合适大小片段的收集管样品(6～9管)，乙醇沉淀，重悬于去离子水中。
2.3 文库质量的检测及扩增
经涂平板检测方法得到的结果：文库的库容为2.03×105。随机挑取10个克隆，在2 mL LB培养基中37 ℃，225～250 r/min，摇床培养过夜。取1 mL菌液，使用质粒小量提取试剂盒提取质粒，得50 μL质粒产物。在25 μL反应体系中加入1 μL质粒产物，M13+与M13-各0.5 μL，2×Taq mix 12.5 μL,其余用PCR超纯水补足。循环条件为：94 ℃ 3 min，30个循环：94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，然后再72 ℃ 10 min。以剩余菌液为模板做菌落PCR，将菌液离心，用牙签沾取沉淀放入加了50 μL无菌水的反应管中，95 ℃裂解5 min。在25 μL反应体系中加入2.5 μL裂解液，M13+与M13-各1.0 μL，2×PCR Taq Mix 12.5 μL，PCR超纯水8.0 μL。循环条件为：94 ℃ 3 min，35个循环：94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，然后72 ℃ 10 min。琼脂糖凝胶电泳，结果表明，每个克隆均有插入片段，重组率94%，插入片段大小大多在0.7～2.5 kb之间，平均大小在1 kb左右(图4)。文库的重组片段大小适合以后的测序及功能基因的研究。 扩增文库的总容量达到2.03×105，适合长期保存。另随机抽取6个菌落送去北京华大基因公司测序：有5个有片段插入， 长度分别为 H1： 1 055 bp; H2： 644 bp; H4：1 948 bp;H5：923 bp;H6：1 386 bp。其中H1和H6为蛋白质编码序列，其他为未知序列。
3 讨 论
要成功构建一个全长cDNA文库，一个关键问题是要分离得到高质量的RNA。而影响总RNA质量的因素主要有3个：一是否有降解;二是否有污染(DNA、蛋白质、小分子物质);三是否完整,即包括生命体所有基因的转录产物。全长cDNA文库的构建是进行分子生物学研究的基本方法之一。它可以很方便地用于分离全长基因以进一步开展基因功能的研究，成功地构建一个全长cDNA文库，分离得到高质量的mRNA是一个前提，并且得到的mRNA种类越多，cDNA文库就越完整，这就对RNA的质量有较高的要求。本研究所提取的 RNA，在琼脂糖凝胶电泳上表现为28 S、18 S、5.8 S三条清晰条带，所提取的RNA经紫外检测，A260/A280=1.77，说明所提取的RNA较纯，没有蛋白污染。SMART技术是近年发展起来的一项利用较少mRNA甚至总RNA建立cDNA文库的方法[ 5-7]。其主要原理是应用5′MART引物得到全长cDNA，并利用LD PCR特异扩增全长cDNA，排除了不完整的cDNA片断，并通过基因组内极其稀有的酶切位点SfiⅠ切割cDNA，得到接头并定向连接到载体中，大大提高了效率。
在cDNA文库构建完成之后，要对载体中插入片段的大小进行检测，本实验分别以质粒DNA、菌落PCR检测后，发现直接作菌落PCR和用质粒DNA作模板进行的PCR检测都能得到同样明确的结果，成功地进行了cDNA文库的鉴定。插入片段长度在600～2 500 bp之间，且长度并不均一，说明所构建的文库具有一定复杂性。
cDNA文库的质量具体反映在两个方面：一是文库的代表性，可用一个量化的指标来衡量，即文库的库容量。本实验所构建的原始cDNA文库具有的独立克隆数为2.03×105个，包括了大部分稀有的mRNA，可以满足大规模测序所用。二是重组cDNA片段的大小。本研究所构建的文库插入片断97%在0.5 kb以上，平均长度为1.0 kb，保证了高比例全长cDNA的获得。
本研究运用Clontech专利的SMART方法,构建了高效的红曲霉全长cDNA文库，经滴度测定、重组率、PCR鉴定均符合cDNA文库的质量要求，可以对其进行随机挑选克隆测序分析，或利用探针、抗体进行文库的筛选以寻找红曲霉的相关功能基因，为下一步红曲霉功能基因的研究以及筛选、克隆红曲霉次生代谢产物合成途径相关基因奠定基础。
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