洛伐他汀合成酶调控基因lovE和mkH的克隆及其序列分析比较
将两基因的测序结果递交DNAMAN软件进行同源性分析比对，两基因相似性较高（核酸序列一致性identity达到67.92%），而将其对应编码的氨基酸序列比对，氨基酸序列一致性identity达到60. 59%，说明了洛伐他汀合成酶调控基因在属间也具有较高的同源性和保守程度。BLASTn比对中得知存在高度相似性（identities分别为67%和74%）。
测序结果的氨基酸序列提交到SWISSPROT数据库通过实用ProtParam程序（http://www.expasy.ch/tools/protparam.html）输出lovE蛋白情况如下：氨基酸数503；分子量55427.3 Da；分子式C2394H3799N709O757S25；原子总数7 684；理论等电点6.08；脂肪族指数75.31；总平均疏水性-0.397。而mkH蛋白情况如下：氨基酸数455；分子量49305.6 Da；分子式C2139H3394N618O673S24；原子总数6 848；理论等电点5.86；脂肪族指数78.29；总平均疏水性-0.296。
3.3.2 亚细胞定位分析 亚细胞定位研究（http://psort.nibb.ac.jp & http://www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/SubLoc/）表明lovE和mkH蛋白未显示典型的N端信号肽区域，SubLoc分别以84%，94%的精确度和RI=3，5的可靠性指数预测两蛋白在核内。SignalP分析（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）预测结果显示两蛋白均非分泌蛋白，且存在信号肽的可能性分别为10.4%和0。
3.3.3 疏水性分析 疏水和亲水是氨基酸固有的特性，蛋白质结构的特征是疏水和亲水间的平衡，其结构的稳定在很大程度上有赖于分子内的疏水作用。疏水性预测和分析对于蛋白质次级结构的预测及功能分析都有较为重要的参考意义。将测序结果递交到服务器http://www.expasy.org/cgibin/protscale.pl采用kyte和Doolittle的方法得出两蛋白大部分氨基酸是亲水的，因此属于亲水蛋白。这也和signalP以及亚细胞定位分析预测结果一致为核内的非分泌蛋白，蛋白通过核孔复合体进入核内需要亲水基团的参与。
3.3.4 蛋白高级结构及功能分析 蛋白质通常含有一些结构域和特殊的保守位点，而这样的结构涉及某种进化起源或者负责特殊的功能。将测序结果递交到自动比较同源蛋白建模服务器SWISS (http://swissmodel.expasy.org/SWISSMODEL.html)及PredictProtein(http://www.predictprotein.org/)对lovE和mkH编码氨基酸序列进行高级结构分析。再通过VAST Search Structure（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vastsearch.html）分析上述获得的pdb文件，其结果用Cn3D软件如图3所示：
图3 蛋白高级结构分析（A为lovE蛋白，B为mkH蛋白）（略）
Figure 3 Advanced structure analysis（A for lovE protein and B for mkH protein）
图3中两蛋白均具有Zn2Cys6双核簇合物的锌指结构DNA结合结构域，该保守结构域发现于如GAL4型的转录因子，曾在酿酒酵母中证实GAL4为半乳糖诱导的基因表达正调控子。此结构域由2个α螺旋环绕成富集半胱氨酸的锌指基序（参与Zn依赖性的DNA结合）并由无规则卷曲串联起来。该类结构域还涉及精氨酸、脯氨酸、嘧啶、奎尼酸盐、麦芽糖和半乳糖的代谢，以及酰胺和α氨基丁酸的降解与亮氨酸的生物合成等。
4 讨论
洛伐他汀是目前治疗高血脂症的常用药物之一。国内工业化生产洛伐他汀的效率并不理想，以致研究者们纷纷以增产洛伐他汀为目标开展多方面的研究。目前从基因工程方面着手改善其产量成为热点。本文克隆的lovE和mkH基因编码产物是一个洛伐他汀生物合成的调控蛋白或转录因子，对其深入研究将有助于理解和控制洛伐他汀生物合成。
Kennedy、Park等将lovE基因突变失活导致检测不到任何洛伐他汀中间产物，同时将一个额外拷贝的lovE转化土曲霉，洛伐他汀产量增加5～7倍［10,16］。从上述数据可以看出对lovE和mkH基因以及其编码蛋白的结构功能的进一步研究将为深入理解洛伐他汀生物合成及其遗传调控方面提供参考，且为进一步表达基因、纯化相关蛋白、制备多克隆抗体、研究基因体外转录、转录因子与DNA的体外模拟结合以深入了解该类转录因子生物学功能和作用机理奠定了实验基础。
本研究利用国际互联网生物信息学资源，通过计算分析两蛋白物理化学特性，得知此两核蛋白和一些转录因子以及调控序列编码产物有共同的GAL4类锌指结构保守序列区。相似性搜索比对得知lovE和mkH不论基因还是编码产物序列都具有高度相似性，存在共同的DNA结合保守序列。
【参考文献】
［1］ AUER J, EBER B. A clinical focus on statins［J］. Curr Opin Investig Drugs, 2001, 2(3):382-388.
［2］ YOON N Y, KIM H R, CHUNG H Y, et al. Antihyperlipidemic effect of an edible brown algae, Ecklonia stolonifera, and its constituents on poloxamer 407induced hyperlipidemic and cholesterolfed rats［J］. Arch Pharm Res, 2008, 31(12):1564-1571.
［3］ SANDHYA V G, RAJAMOHAN T. Comparative evaluation of the hypolipidemic effects of coconut water and lovastatin in rats fed fatcholesterol enriched diet［J］. Food Chem Toxicol, 2008, 46(12):3586-3592.
［4］ DICHTL W, DULAK J, FRICK M, et al. HMGCoA reductase inhibitors regulate inflammatory transcription factors in human endothelial and vascular smooth muscle cells［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2003, 23(1): 58-63.
［5］ MUSUNURU K, BLUMENTHAL R S. The implications of the ezetimibe and simvastatin in hypercholesterolemia enhances atherosclerosis regression trial: a return to first principles［J］. Clin Cardiol, 2008, 31(6):288-290.
［6］ ZHONG W B, WANG C Y, CHANG T C, et al. Lovastatin induces apoptosis of anaplastic thyroid cancer cells via inhibition of protein geranylgeranylation and de novo protein synthesis［J］. Endocrinology, 2003, 144(9): 3852-3859.
［7］ LAEZZA C, FIORENTINO
将测序结果提交到GeneBank中进行blastn（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）比对，lovE和mkH分别与GeneBank中登录号为AF141925.1和DQ176595.1(分别编码Aspergillus terrus调控蛋白和Monascus pilosus转录因子)的相似性达到99. 9%和100%，表明克隆片段应为洛伐他汀合成酶调控基因。且lovE基因长1 512 bp，编码503个氨基酸，不含内含子结构；而mkH基因长1 464 bp，编码455个氨基酸，且含有一长为96 bp的内含子。
将两基因的测序结果递交DNAMAN软件进行同源性分析比对，两基因相似性较高（核酸序列一致性identity达到67.92%），而将其对应编码的氨基酸序列比对，氨基酸序列一致性identity达到60. 59%，说明了洛伐他汀合成酶调控基因在属间也具有较高的同源性和保守程度。BLASTn比对中得知存在高度相似性（identities分别为67%和74%）。
测序结果的氨基酸序列提交到SWISSPROT数据库通过实用ProtParam程序（http://www.expasy.ch/tools/protparam.html）输出lovE蛋白情况如下：氨基酸数503；分子量55427.3 Da；分子式C2394H3799N709O757S25；原子总数7 684；理论等电点6.08；脂肪族指数75.31；总平均疏水性-0.397。而mkH蛋白情况如下：氨基酸数455；分子量49305.6 Da；分子式C2139H3394N618O673S24；原子总数6 848；理论等电点5.86；脂肪族指数78.29；总平均疏水性-0.296。
3.3.2 亚细胞定位分析 亚细胞定位研究（http://psort.nibb.ac.jp & http://www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/SubLoc/）表明lovE和mkH蛋白未显示典型的N端信号肽区域，SubLoc分别以84%，94%的精确度和RI=3，5的可靠性指数预测两蛋白在核内。SignalP分析（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）预测结果显示两蛋白均非分泌蛋白，且存在信号肽的可能性分别为10.4%和0。
3.3.3 疏水性分析 疏水和亲水是氨基酸固有的特性，蛋白质结构的特征是疏水和亲水间的平衡，其结构的稳定在很大程度上有赖于分子内的疏水作用。疏水性预测和分析对于蛋白质次级结构的预测及功能分析都有较为重要的参考意义。将测序结果递交到服务器http://www.expasy.org/cgibin/protscale.pl采用kyte和Doolittle的方法得出两蛋白大部分氨基酸是亲水的，因此属于亲水蛋白。这也和signalP以及亚细胞定位分析预测结果一致为核内的非分泌蛋白，蛋白通过核孔复合体进入核内需要亲水基团的参与。
3.3.4 蛋白高级结构及功能分析 蛋白质通常含有一些结构域和特殊的保守位点，而这样的结构涉及某种进化起源或者负责特殊的功能。将测序结果递交到自动比较同源蛋白建模服务器SWISS (http://swissmodel.expasy.org/SWISSMODEL.html)及PredictProtein(http://www.predictprotein.org/)对lovE和mkH编码氨基酸序列进行高级结构分析。再通过VAST Search Structure（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vastsearch.html）分析上述获得的pdb文件，其结果用Cn3D软件如图3所示：
图3 蛋白高级结构分析（A为lovE蛋白，B为mkH蛋白）（略）
Figure 3 Advanced structure analysis（A for lovE protein and B for mkH protein）
图3中两蛋白均具有Zn2Cys6双核簇合物的锌指结构DNA结合结构域，该保守结构域发现于如GAL4型的转录因子，曾在酿酒酵母中证实GAL4为半乳糖诱导的基因表达正调控子。此结构域由2个α螺旋环绕成富集半胱氨酸的锌指基序（参与Zn依赖性的DNA结合）并由无规则卷曲串联起来。该类结构域还涉及精氨酸、脯氨酸、嘧啶、奎尼酸盐、麦芽糖和半乳糖的代谢，以及酰胺和α氨基丁酸的降解与亮氨酸的生物合成等。
4 讨论
洛伐他汀是目前治疗高血脂症的常用药物之一。国内工业化生产洛伐他汀的效率并不理想，以致研究者们纷纷以增产洛伐他汀为目标开展多方面的研究。目前从基因工程方面着手改善其产量成为热点。本文克隆的lovE和mkH基因编码产物是一个洛伐他汀生物合成的调控蛋白或转录因子，对其深入研究将有助于理解和控制洛伐他汀生物合成。
Kennedy、Park等将lovE基因突变失活导致检测不到任何洛伐他汀中间产物，同时将一个额外拷贝的lovE转化土曲霉，洛伐他汀产量增加5～7倍［10,16］。从上述数据可以看出对lovE和mkH基因以及其编码蛋白的结构功能的进一步研究将为深入理解洛伐他汀生物合成及其遗传调控方面提供参考，且为进一步表达基因、纯化相关蛋白、制备多克隆抗体、研究基因体外转录、转录因子与DNA的体外模拟结合以深入了解该类转录因子生物学功能和作用机理奠定了实验基础。
本研究利用国际互联网生物信息学资源，通过计算分析两蛋白物理化学特性，得知此两核蛋白和一些转录因子以及调控序列编码产物有共同的GAL4类锌指结构保守序列区。相似性搜索比对得知lovE和mkH不论基因还是编码产物序列都具有高度相似性，存在共同的DNA结合保守序列。
【参考文献】
［1］ AUER J, EBER B. A clinical focus on statins［J］. Curr Opin Investig Drugs, 2001, 2(3):382-388.
［2］ YOON N Y, KIM H R, CHUNG H Y, et al. Antihyperlipidemic effect of an edible brown algae, Ecklonia stolonifera, and its constituents on poloxamer 407induced hyperlipidemic and cholesterolfed rats［J］. Arch Pharm Res, 2008, 31(12):1564-1571.
［3］ SANDHYA V G, RAJAMOHAN T. Comparative evaluation of the hypolipidemic effects of coconut water and lovastatin in rats fed fatcholesterol enriched diet［J］. Food Chem Toxicol, 2008, 46(12):3586-3592.
［4］ DICHTL W, DULAK J, FRICK M, et al. HMGCoA reductase inhibitors regulate inflammatory transcription factors in human endothelial and vascular smooth muscle cells［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2003, 23(1): 58-63.
［5］ MUSUNURU K, BLUMENTHAL R S. The implications of the ezetimibe and simvastatin in hypercholesterolemia enhances atherosclerosis regression trial: a return to first principles［J］. Clin Cardiol, 2008, 31(6):288-290.
［6］ ZHONG W B, WANG C Y, CHANG T C, et al. Lovastatin induces apoptosis of anaplastic thyroid cancer cells via inhibition of protein geranylgeranylation and de novo protein synthesis［J］. Endocrinology, 2003, 144(9): 3852-3859.
［7］ LAEZZA C, FIORENTINO L, PISANTI S, et al. Lovastatin induces apoptosis of krastransformed thyroid cells via inhibition of ras farnesylation and by modulating redox state［J］. J Mol Med, 2008, 86(12):1341-1351.
［8］ YU X, LUO Y, ZHOU Y, et al. BRCA1 overexpression sensitizes cancer cells to lovastatin via regulation of cyclin D1CDK4p21WAF1/CIP1 pathway: analyses using a breast cancer cell line and tumoral xenograft model［J］. Int J Oncol, 2008, 33(3):555-563.
［9］ HENDRISKSON L, DAVIS C R, ROACH C, et al. Lovastatin biosynthesis in Aspergillus terrus: characterization of blocked mutants, enzyme activities and a mulifunctional polyketide synthase gene［J］. Chem Biol, 1999, 6(7): 429439.
［10］ KENNEDY J, AUCLAIR K, KENDREW S G, et al. Modulation of polyketides synthase activity by accessory proteins during lovastatin biosynthesis［J］. Science,1999, 284(5418): 1368-1372.
［11］ SUTHERLAND A, AUCLAIR K, VEDERAS J C. Recent advances in the biosynthetic studies of lovastatin ［R］. Curr Opin Drug Discov Devel, 2001, 4(2): 229-236.
［12］ TODD R B, ANDRIANOPOULOS A. Evolution of a fungal regulatory gene family: The Zn(II)2Cys6 binuclear cluster DNA binding motif［J］. Fungal Genet Biol, 1997, 21(3): 388-405.
［13］ CHEN Y P, TSENG C P, LIAW L L, et al. Cloning and characterization of monacolin K biosynthetic gene cluster from Monascus pilosus［J］. Agriculture and Food Chemistry, 2008, 56(14):5639-5646.
［14］ HUTCHINSON C R, KENNEDY J, PARK C, et al. Aspects of the biosynthesis of nonaromatic fungal polyketides by iterative polyketide synthases［J］. Antonie Van Leeuwenhoek, 2000, 78, 287-295.
［15］ 诸葛健, 王正祥. 工业微生物实验技术手册［M］. 北京: 中国轻工业出版社, 1994: 109-112.
［16］ PARK C, HUTCHINSON C R, KENNEDY J. Method of producing antihypercholesterolemic agents ［P］. US Patent, 2004033570, 2004-02-19.
L, PISANTI S, et al. Lovastatin induces apoptosis of krastransformed thyroid cells via inhibition of ras farnesylation and by modulating redox state［J］. J Mol Med, 2008, 86(12):1341-1351.
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［9］ HENDRISKSON L, DAVIS C R, ROACH C, et al. Lovastatin biosynthesis in Aspergillus terrus: characterization of blocked mutants, enzyme activities and a mulifunctional polyketide synthase gene［J］. Chem Biol, 1999, 6(7): 429439.
［10］ KENNEDY J, AUCLAIR K, KENDREW S G, et al. Modulation of polyketides synthase activity by accessory proteins during lovastatin biosynthesis［J］. Science,1999, 284(5418): 1368-1372.
［11］ SUTHERLAND A, AUCLAIR K, VEDERAS J C. Recent advances in the biosynthetic studies of lovastatin ［R］. Curr Opin Drug Discov Devel, 2001, 4(2): 229-236.
［12］ TODD R B, ANDRIANOPOULOS A. Evolution of a fungal regulatory gene family: The Zn(II)2Cys6 binuclear cluster DNA binding motif［J］. Fungal Genet Biol, 1997, 21(3): 388-405.
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［14］ HUTCHINSON C R, KENNEDY J, PARK C, et al. Aspects of the biosynthesis of nonaromatic fungal polyketides by iterative polyketide synthases［J］. Antonie Van Leeuwenhoek, 2000, 78, 287-295.
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［16］ PARK C, HUTCHINSON C R, KENNEDY J. Method of producing antihypercholesterolemic agents ［P］. US Patent, 2004033570, 2004-02-19.