洛伐他汀合成酶调控基因lovE和mkH的克隆及其序列分析比较
作者：黄欣 朱碧云 吕带弟 陈伟立 黄晓琳 李浩明
【摘要】 目的 克隆红曲霉和土曲霉洛伐他汀合成酶调控基因lovE和mkH，并进行序列分析和同源性比较。方法 根据GeneBank土曲霉和红曲霉洛伐他汀合成酶基因序列设计引物，以土曲霉和红曲霉基因组DNA为模板PCR扩增lovE和mkH基因并克隆到pMD19T simple载体。利用DNAMAN等软件以及互联网资源对lovE和mkH测序结果与其编码的氨基酸序列进行分析比对。结果 分别扩增得到1 512 bp和1 464 bp的目的片段lovE和mkH。结论 lovE和mkH同源性很高，并与GeneBank中相关已知序列基本相同，是洛伐他汀生物合成酶调控基因，且其表达产物为GAL4类转录因子。
【关键词】 土曲霉 红曲霉 洛伐他汀 转录因子 调控基因
洛伐他汀是胆固醇生物合成中的关键酶HMGCoA还原酶的竞争性抑制剂，是目前治疗高血脂症最有效的药物之一［1-3］，它可下调炎症相关转录因子的表达，减缓动脉粥样硬化［4,5］，并可促进恶性甲状腺细胞凋亡［6,7］，具有抑制乳腺癌细胞增殖的功能［8］。
土曲霉洛伐他汀合成酶基因簇包括lovAlovG以及lovI和lvrA等基因［9-11］。红曲霉洛伐他汀合成酶基因簇包括mkAmkI等9个基因。其中lovE和mkH分别是土曲霉和红曲霉洛伐他汀生物合成的调控基因，编码GAL4类转录因子，其氨基酸序列中半胱氨酸富集的DNA结合区域表明含有Zn2Cys6型锌指结构域［12-14］。为深入研究洛伐他汀生物合成调控基因的生物学功能并利用这类转录因子来调控洛伐他汀合成代谢，本研究首次从国内常用工业原始出发菌株土曲霉CCTCC AF93208和红曲霉CICC5031基因组中PCR扩增克隆洛伐他汀合成酶调控基因，并对该基因和其编码的蛋白产物进行序列分析对比。
1 实验材料
1.1 菌株和培养基
土曲霉（Aspergillus terrus）CCTCC AF93208：中国典型培养物保藏中心;红曲霉（Monascus anka）CICC 5031：中国工业微生物菌种保藏中心;大肠杆菌DH5α为本实验室保藏;大肠杆菌LB培养基和LB/Amp培养基均按实验室常用培养基的配置方法配置。
斜面培养基［15］（g/L）：察氏培养基（蔗糖 30 g，NaNO3 3 g，K2HPO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0. 5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，琼脂 15 g，纯净水 1 000 mL）。
菌丝生长培养基［15］（g/L）：葡萄糖 50 g，酵母膏 10 g，番茄酱 20 g，CaCO3 1 g，pH 7.2～7.5。
1.2 试剂
PCR引物由英俊生物技术有限公司合成。Taq酶采用fermentas的Taq recombinant。OMEGA的胶回收试剂盒D250101。Takara公司的pMD19T simple克隆载体。Takara公司的DNA Marker DL2000和100 bp ladder。其他常规化学试剂均为国产分析纯。
2 实验方法
2.1 培养方法
用2 mL无菌水冲洗孢子，接入固体斜面培养。固体斜面培养7 d后，以5 mL水洗下，稀释至浓度为107个/mL，取2 mL加入100 mL菌丝生长培养基，转速150 r/min，28℃培养4 d。
2.2 基因组DNA提取
过滤取菌丝球（尽量吸干），称重并转入-20℃预冷的研钵。每克菌丝球加入3 g石英砂，0.4 mL提取液［100 mmol/L TrisHCl(pH8.0),20 mmol/L Na2EDTA,0.5 mol/L NaCl,1% SDS］，0.5 mL有机液（酚/氯仿/异戊醇 （体积比）25∶24∶1）。将上述混合物于预冷研钵中剧烈研磨1 min直到成黏稠状细粉。每克菌丝球再加入4 mL提取液，2 mL有机液，充分混匀。用已剪枪头吸转至1.5 mL EP管，室温16 000 g离心5 min。吸转水相到新管，加0.6倍体积异丙醇，室温静置10 min，4 ℃16 000 g离心15 min，弃废液。95%乙醇润洗沉淀，稍微风干。加340 μL重溶液1［10 mmol/L TrisHCl(pH8.0),1 mmol/L Na2EDTA,20 μg/mL RNaseA］，37℃水浴30 min。按前比例有机液再抽提一次，300 μL水相转新管。加入0.5倍体积7.5 mol/L乙酸铵溶液和2. 5倍体积95%乙醇均匀混合，-20℃静置30 min，4℃16 000 g离心15 min，弃废液。95%乙醇润洗沉淀，风干。每管加入100 μL重溶液2［10 mmol/L TrisHCl(pH8.0),1 mmol/L Na2EDTA］，-20 ℃保存［16］。
2.3 PCR引物设计
根据GeneBank上公布的土曲霉和红曲霉洛伐他汀生物合成基因簇（登录号为AF141925和DQ176595）中lovE和mkH基因设计如下引物扩该基因。lovEF: ATGGCTGCAGATCAAGGTATAT；lovER: TCATGGAGGAATATTGTTGAGG；预期lovE产物大小为1 512 bp。mkHF: TTAGGAGGCCAGGTTGTGTTGG；mkHR: ATGGCCCTATCGCCAGTCCAGG；预期mkH产物大小为1 464 bp。
2.4 PCR反应
反应体系：10×buffer 2 μL，25 mmol/L MgCl2 1. 2 μL,10 μmol/L dNTPs 0.4 μL,20 μmol/L 引物组各0.4 μL，ddH2O 14.5 μL，DNA 1 μL，Taq酶 0.1 μL。总体系20 μL。
热循环条件：94 ℃预变性5 min后，以94 ℃30 s，50 ℃20 s，72 ℃1 min 40 s程序循环40次，延伸72 ℃20 min。
2.5 目的片段的克隆与测序
1%的琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，再按胶回收试剂盒操作回收纯化PCR产物。按pMD19T simple载体1 μL，回收DNA4 μL，solutionⅠ（含T4连接酶和连接酶缓冲液）5 μL的比例轻轻打匀于16 ℃水浴连接2 d。大肠杆菌DH5α感受态制备及转化均按分子克隆指南方法操作。克隆片段交由英俊生物技术有限公司双脱氧法双向测定并拼接。
2.6 转化子验证
蓝白斑筛选挑取白斑单克隆菌落PCR验证。
反应体系：10×buffer 1 μL，25 mmol/L MgCl2 1. 2 μL,10 μmol/L dNTPs 0.2 μL,20 μmol/L 引物组各0.2 μL，ddH2O 7.15 μL，DNA 无菌枪头蘸取，Taq酶 0.1 μL。总体系10 μL。
热循环条件：94℃预变性5 min后，以94 ℃30 s，50 ℃20 s，72 ℃1 min40 s程序循环30次，延伸72 ℃ 5 min。
2.7 序列分析比对
采用DNAMAN软件将测序结果与GeneBank已知序列进行比对，并通过NCBI等网络资源分析基因序列及其对应蛋白的理化性质、高级结构和功能。
3 结果与分析
3.1 PCR扩增结果
见图1，表明对lovE和mkH扩增得到与预期大小一致的产物，约为1 500 bp。
M为DNA Marker DL2000（从上至下分别是2 000 bp，1 000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp）；0为阴性对照即没加模
图1 PCR扩增结果（A为lovE，B为mkH）（略）
Figure 1 Electrophoresis of PCR products on 1% agarose gel（A for lovE and B for mkH）
3.2 菌落PCR验证结果
见图2，对lovE和mkH扩增得到了与预期大小一致的产物，约为1 500 bp。
A图中M为DNA marker 100 bp ladder（从上至下分别是1 500 bp，1 000 bp，900 bp，800 bp，700 bp，600 bp，500 bp，400 bp，300 bp，200 bp，100 bp）；B图中M为DNA Marker DL2000（从上至下分别是2 000 bp，1 000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp）；0为阴性对照即没加模板DNA；A图中1-9是lovE的菌落PCR扩增结果；B图中1-6是mkH的菌落PCR扩增结果
图2 菌落PCR结果（A为lovE，B为mkH）（略）
Figure 2 Electrophoresis of colony PCR products on 1% agarose gel（A for lovE and B for mkH）
3.3 扩增片段测序结果及分析
3.3.1 核苷酸及氨基酸分析 将重组菌种交英俊生物技术有限公司测序，lovE的3次测序结果与GeneBank中lovE通过DNAMAN比对仅在第614位碱基处由C置换了T，编码的氨基酸也仅在第205位氨基酸处由Ala置换了Val；而mkH的3次测序结果与GeneBank中mkH完全一致。由此可见两者之间的差异可能是个体多态性，也证明了洛伐他汀合成酶调控基因种间保守程度极高。