宝宝乐口服液对瘦素调节VMN神经元膜电位的影响
作者：杜永平 张月萍 郭姣 孙亚娟 杜兰芳 张国成
【摘要】 目的 研究宝宝乐口服液对瘦素调节下丘脑腹内侧核(VMH)神经元膜电位的影响。方法 利用红外可视脑片膜片钳技术记录对照组、厌食组和治疗组三组模型动物VMN神经元的膜电位，分析瘦素及宝宝乐口服液对VMN神经元膜电位的影响。结果 瘦素使三组动物大部分神经元去极化，各组间比较差异无显著性。少数VMN神经元在瘦素作用下超极化，各组间比较差异亦无显著性。但模型组VMN神经元的膜电位被瘦素去极化而导致自发放电增加的细胞比例增多，被瘦素超极化而自发放电减少的细胞比例减少，对瘦素无反应的细胞比例也减少；而治疗组去极化、超极化和无反应的细胞数与对照组差异无显著性。结论 宝宝乐口服液能够通过影响降低VMN对瘦素的整体敏感性，使VMN发出适度的饱信号，从而恢复正常的食欲和摄食量。
【关键词】 宝宝乐口服液 下丘脑腹内侧核 膜电位 膜片钳
小儿厌食是常见的摄食行为异常，发生率约为12%～34%，对儿童生长发育影响较大，对小儿厌食发生发展及其特效疗法的深入研究将有助于推动人类对摄食生理调控机制的进一步认识和提高儿童健康水平［1］。近20年来，国内学者广泛使用以恢复脾胃运转之机，使脾胃调和、脾运复健为主要目的的运脾法为治则，治疗小儿厌食取得很好疗效，并系统研究了运脾法对消化吸收功能的影响，在外周水平上证实运脾法对胃肠道的运动和分泌有显著的调节作用［2］。在以往的研究中，我们采用病因模拟法成功制作了幼龄大鼠厌食模型［3］，并就运脾复方对该模型中枢和外周胃肠激素的调节作用［4］、对厌食大鼠下丘脑腹内侧核（ventromedial hypothalamic nuclui，VMN）神经元外周摄食负反馈信息的敏感性的影响进行了研究，取得了一些成果［5］。为进一步探讨小儿厌食症的发病机制和运脾复方的作用机制，观察了运脾复方宝宝乐口服液对瘦素调节VMN神经元膜电位的影响。
1 材料与方法
1.1 动物及分组
日龄35～40 d的SD大鼠45只，平均体质量(60±10)g（第四军医大学实验动物中心提供），合格证号SCXK（军）200707。随机分为对照组、模型组和治疗组，每组15只。所有动物均单笼饲养，自由进食水。
1.2 模型制备和药物治疗
按文献方法［3］ 制做厌食大鼠模型。即用正常鼠饲料喂养对照组大鼠，用特制饲料喂养模型组和治疗组大鼠。1周后特制饲料喂养的大鼠日摄食量下降30%以上，体质量下降15%以上，表明模型制备成功。从实验第8天开始，治疗组大鼠用运脾复方宝宝乐口服液（第四军医大学科西京医院药剂科提供，药物组成：苍术、焦山楂、黄芪、党参、陈皮各10 g,白芍、决明子、煅龙骨、煅牡蛎各20 g）灌胃，每日1次，剂量为3.76 g/100 g(为临床2倍等效量)，同时给予对照组和模型组大鼠等容积生理盐水灌胃，连续3周。
1.3 膜片钳记录
大鼠腹腔注射10%(φ)水合氯醛（0.33 mL/100 g），麻醉后断头取脑，迅速置于冰水混合的细胞外液（NaCl 126，KCl 2.5，Na2HPO4 1.2， NaHCO3 24，Glucose 11.1，MgSO4 1.2，CaCl2 2.4，单位mmol·L-1，pH7.2～7.4，渗透压浓度299 mOsm）中充氧（95%O2和5%CO2，下同）1 min，移至振动切片机（机槽内注满持续充氧的冰水细胞外液）做200 μm厚的横切面脑片，置入28 ℃持续充氧的细胞外液中孵育1 h，然后在正置纤维镜（Axoskop I；Zeiss，Thornwood，NY）水浸镜头下进行可视膜片钳记录，膜片钳放大器使用MultiClamp 700B（Axon Instruments，美国）。pClamp8软件（Axon Instrument，Foster City，CA）用来记录和分析数据。
全细胞记录（whole cell patch）使用的电极内液成分(单位:mmol·L-1)为：Kgluconate132.3，NaCl 4，CaCl2 0.5，Hepes 10，EGTA 5，ATPMg 4，GTPNa 0.5，Phosphocretin 10，pH 7.2～7.3，渗透压280 mOsm，充灌电极后的电极电阻为6～8 MΩ。电极尖端与细胞膜形成高阻封接（达1～10 GΩ），然后吸破细胞膜，在电流钳gapfree状态下持续记录膜电位，观察瘦素（Leptin，50 nmol·L-1）对VMN神经元膜电位的影响，取给药前5 min的基础膜电位与给药最后1min的膜电位进行比较。
所有的化学试剂和药理试剂均购自Sigma公司。
1.4 统计学处理
实验数据采用均数±标准差(±s) 表示,采用t检验和χ2检验,以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
在对照组（n=15）、模型组（n=16）和治疗组（n=14）大鼠脑片上观察了瘦素对VMN神经元膜电位的影响。瘦素使大部分神经元去极化（如图1A示），膜电位改变为：对照组（5.01±1.23）mV（n=8），模型组（4.94±0.76）mV（n=13），治疗组（4.99±0.83）mV（n=6），各组间比较差异无显著性。少数VMN神经元在瘦素作用下超极化（如图1B示），膜电位改变为：对照组（4.16±0.72）mV（n=3），模型组4.85 mV（n=1），治疗组（3.88±0.94）mV（n=3），各组间比较差异亦无显著性。然而，模型组VMN神经元的膜电位被瘦素去激化而导致自发放电增加的细胞比例增多，被瘦素超极化而自发放电减少的细胞比例减少，对瘦素无反应的细胞比例也减少。这些结果与瘦素对VMN神经元mIPSC的影响一致，进一步表明瘦素使模型大鼠VMN神经元的兴奋性增强。而治疗组去极化、超极化和无反应的细胞数与对照组差异无显著性（图1C），提示宝宝乐口服液能降低瘦素对模型大鼠VMN神经元的去极化作用。
与对照组比较:*P<0.05
A示瘦素使一个VMN神经元去极化，自发放电显著增加，停止灌流瘦素后膜电位未恢复；B示瘦素使另一个VMN神经元超极化，自发放电消失，停止灌流瘦素后膜电位基本恢复。C示三组大鼠VMN被灌流瘦素去极化、超极化和无反应的神经元构成比。
图1 瘦素对三组大鼠VMN神经元膜电位的影响（略）
Figure 1 Effects of leptin on membrane potential of VMN neurons