高效液相色谱法测定帕米膦酸二钠中的β丙氨酸
【摘要】 目的 建立帕米膦酸二钠中β丙氨酸的检测方法。 方法 采用高效液相色谱法，以Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)为色谱柱，以甲醇0.01 mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用氢氧化钠调节pH值至7.0)(体积比30∶70)为流动相，流速为1.0 mL/min，检测波长为360 nm。结果 β丙氨酸的质量浓度在3～18 μg/mL范围内与峰面积呈较好的线性关系，回归方程为y=0.0445x+0.2010,r=0.998 6；平均回收率为99.1%，RSD=1.9%。结论 该法简便、灵敏度高，可用于帕米膦酸二钠中β丙氨酸的质量控制。
【关键词】 帕米膦酸二钠 β丙氨酸 高效液相色谱法
帕米膦酸二钠是一种双膦酸类骨吸收抑制剂，临床上广泛应用于治疗骨质疏松症、肿瘤并发的高钙血症和变形性骨炎［1-3］。帕米膦酸二钠的合成主要以β丙氨酸为原料，同时也是降解的主要产物，因此需要控制帕米膦酸二钠中β丙氨酸的量(拟定为不得超过0.3％)。第30版美国药典、2007年版英国药典和国家食品药品监督管理局国家药品标准WS1—(X—294)—2004Z中，帕米膦酸二钠中β丙氨酸的限度检查均采用薄层色谱法。由于薄层色谱法专属性和灵敏度均不如高效液相色谱法，故本文利用2，4二硝基氟苯与β丙氨酸的胺基进行耦合反应(见图1)，结果衍生物具有紫外吸收，采用紫外检测高效液相色谱法对帕米膦酸二钠中β丙氨酸的限度进行检查。帕米膦酸二钠已被列为中国药典2010年版二部拟新增品种，作为承担单位，本实验方法拟收载在中国药典2010年版二部。
图1 2，4二硝基氟苯与β丙氨酸的反应（略）
Figure 1 Reaction of 2,4dinitrofluorobenzene and βalanine
1 仪器与试药
Agilent 1100 高效液相色谱仪，VWD检测器及其配套色谱工作站；2，4二硝基氟苯(International Laboratory USA，批号：194632，质量分数：99.9％)；β丙氨酸对照品(广东信立泰药业有限公司提供，批号：20061120,质量分数：99.4%)；帕米膦酸二钠(深圳信立泰药业有限公司，批号：20080201；宁波人健药业有限公司，批号：070107、070104、070110；浙江迪耳药业有限公司，批号：060403)；水为超纯水；甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇0.01 mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用氢氧化钠调节pH值至7.0)(体积比30∶70)；流速：1.0 mL/min；柱温：40 ℃；检测波长：360 nm。
2.2 溶液的制备
供试品溶液：精密称取本品适量，加水溶解并稀释制成每1 mL含帕米膦酸二钠3 mg的溶液，作为供试品溶液。
对照品溶液：精密称取β丙氨酸0.045 25 g置100 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，精密量取2 mL置100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
空白溶液：水。
精密量取供试品溶液、对照品溶液和空白溶液各2 mL，分别置10 mL量瓶中，加水3 mL、质量分数5%的碳酸钠水溶液1.0 mL和质量分数4%的2，4二硝基氟苯乙腈溶液2.0 mL，摇匀后立刻在40 ℃下反应2 h，取出，放冷，加水稀释至刻度，摇匀，作为反应后的供试品溶液、对照品溶液和空白溶液。
2.3 专属性试验
精密量取反应后的对照品溶液、供试品溶液(浙江迪耳药业有限公司，批号：060403)和空白溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图(见图2)。由图可知，空白辅料无干扰，反应后的衍生物主峰与相邻峰的分离度符合要求。
1.β丙氨酸
图2 β丙氨酸对照品溶液(A)、供试品溶液(B)和空白溶液(C)的色谱图（略）
Figure 2 Chromatograms of the reference solution (A)，the test solution (B) and the blank solution (C)
2.4 回收率试验
取同一批未检出β丙氨酸的帕米膦酸二钠（深圳信立泰药业有限公司）适量，加水制成每1 mL含6.0 mg的溶液，作为供试品溶液；另根据拟控制的β丙氨酸限度（0.3%），取β丙氨酸适量逐步稀释为每1 mL含18 μg的溶液，作为对照溶液。将供试品溶液与杂质对照溶液按比例混匀配制为含β丙氨酸为限度80%、100％、120％的溶液，测得回收率分别为96.9%、98.8%、97.5%、99.5%、99.2%、101.1%、100.8％、101.7％、96.2％，平均回收率为99.1%，RSD为1.9%。
2.5 线性方程
取对照溶液适量，按比例稀释为含β丙氨酸3、6、9、12、15、18 μg/mL的溶液，分别相当于“2.2”项下供试品溶液的0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0. 5%、0.6%的限度对照溶液，依法测定，以峰面积为横坐标，以质量浓度为纵坐标，得线性回归方程为y=0.0445x+0.2010,r=0.998 6，表明β丙氨酸质量浓度在3～18 μg/mL范围内与峰面积呈较好的线性关系，符合限度实验的要求。