穿心莲种子蛋白质电泳鉴定的初步研究

【摘要】  目的探讨SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对穿心莲种子进行鉴别的可行性，为穿心莲种子鉴别及育种研究提供科学依据。方法 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对广东省几种不同来源和不同采收期的穿心莲种子进行可溶性蛋白质电泳研究。结果 不同产地的穿心莲种子蛋白质电泳图谱之间在谱型和谱带的强弱、蛋白质相对含量上均有一定的差异，不同采收期穿心莲种子蛋白质电泳在蛋白质谱带的强弱上有一定差异。结论 聚丙烯酰胺凝胶电泳技术可用于穿心莲种子鉴定。

【关键词】  穿心莲;聚丙烯酰胺凝胶电泳;种子;鉴定

　Abstract:ObjectiveTo explore the feasibility of seed identification with SDS-PAGE,and provide scientific basis for breeding of Andrographis paniculata.Methods SDS-PAGE polyacrylamide gel electrophoresis technology was adopted for analyzing soluble proteins of several different sources and different collection time in Guangdong.Results Significant differences were observed in spectral pattern,contents of proteins and intensity of bands of Andrographis paniculata from different origins,and in spectral degree between various collection time.Conclusion Polyacrylamide gel electrophoresis technology can be used for seed identification of Andrographis paniculata seeds.

　　Key words:Andrographis paniculata; polyacrylamide gel electrophoresis; seed; identification

　　穿心莲Andrographis paniculata(Burm.f.)Nees为爵床科植物，具有清热解毒、凉血消肿等功能,临床上常用于急性菌痢、胃肠炎、感冒、流脑、气管炎、高血压等疾病的治疗[1]。研究表明，不同产地、不同采收期的穿心莲性状、成分差异较大，种子混杂现象也较严重[2]。中药材种子所含蛋白质的种类和数量携带了其长期演化的遗传特征，具有很高的稳定性和专属性，其真伪和品种鉴别是中药集约化生产的重要环节和前提。1991年国际种子检验协会将蛋白质电泳方法正式定为标准的品种鉴定方法。目前，蛋白质电泳技术迅速发展和日臻完善，但大多应用于玉米、棉花等植物中[3-4]，应用于药用植物的研究尚为数不多[5-7]。笔者收集了几种不同产地和不同采收期的穿心莲种子，利用蛋白质电泳技术对其进行检测，旨在为穿心莲种质资源的保护、评价，种子的鉴定及育种提供参考依据。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　采集4个不同地区和同一地区3种不同采收期的成熟穿心莲果实，室温下阴干，待果皮自然裂开弹出种子。收集于种子瓶中置室温阴凉处保存，各种子来源见表1。

　　1.2仪器与试剂

　　DYY-11型电泳仪(北京市六一仪器厂)，DYCZ-24DN双垂直平电泳槽(北京市六一仪器厂)，TDL80-2B台式离心机、HK3300H超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)，PHS-30酸度计(上海精密科学仪器有限公司)，HC-TP12-2型架盘药物天平(北京医用天平厂)。表1穿心莲种子来源2 mol·L-1 Tris-HCl(pH=8.8)，1 mol·L-1Tris-HCl(pH=6.8)，10%(质量浓度)SDS，50%(体积分数)甘油，1%(质量浓度)溴酚蓝，考马斯亮蓝R-250染液(取0.04 g考马斯亮蓝R-250，加入甲醇18 mL、蒸馏水18 mL和冰醋酸4 mL，即得)，考马斯亮蓝脱色液(10 mL甲醇、10 mL冰醋酸和80 mL蒸馏水混匀)，30%(质量浓度,下同)丙烯酰胺，0.8%N，N’-甲叉双丙烯酰胺，10%SDS，10%过硫酸铵，1%溴酚蓝。

　　1.3方法

　　1.3.1样品缓冲液的制备取1 mol·L-1的Tris-HCl 0.6 mL，加入50%(体积分数)的甘油5 mL、10%(体积分数)的SDS 2 mL、 2-硫基乙醇0.5 mL、1%(质量分数)溴酚蓝1 mL和蒸馏水0.9 mL，4 ℃冰箱中存放，备用。

　　1.3.2丙烯酰胺储存液100 mL(A液)30%丙烯酰胺、0.8%双丙烯酰胺。

　　1.3.34×分离胶缓冲液100 mL(B液)2 mol·L-1Tris-HCl 75 mL、10%SDS 4 mL，蒸馏水21 mL。

　　1.3.44×浓缩胶缓冲液100 mL(C液)取1 mol·L-1 Tris-HCl 50 mL，加入10%SDS 4 mL，再加入蒸馏水46 mL，即得。

　　1.3.55%浓缩胶蒸馏水2.3 mL，A液0.67 mL，C液1.0 mL，10%过硫酸铵30 μL，TEMED 5 μL。

　　1.3.612%分离胶A液4 mL，B液2.5 mL，蒸馏水3.5 mL，10%过硫酸铵50 μL，TEMED 5 μL。

　　1.3.7样品溶液的制备[8]取穿心莲种子0.5 g，加入稀释5倍的样品缓冲液(pH6.8)2 mL，3%聚乙烯毗咯烷酮(PVP)，冰浴下研磨，加入稀释4倍的5%浓缩胶缓冲液1 mL，振摇，混匀，超声20 min，室温离心20 min(4 000 r·min-1)。取上清液，离心20 min(4 000 r·min-1)， 取上清液， 加入石油醚 2 mL，振摇2 min，静止分层。吸取下层液体，加入适量冷丙酮，振摇，置4 ℃冰箱30 min，取出，离心5 s(4 000 r·min-1)，弃去丙酮，风干。沉淀物加入样品缓冲液2～3 mL，振摇2 min，超声5～10 min，待溶解完全后，室温下离心5 min(4 000 r·min-1)，取上清液，置4 ℃冰箱中存放，备用。

　　1.3.8电泳缓冲液的配制取Tris碱3 g、甘氨酸14.4 g和SDS 1 g， 加入蒸馏水至1 L， pH 8.3， 在 4 ℃冰箱中存放，备用。

　　1.3.9电泳操作采用1 mm厚的SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳，浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度12%，电极缓冲液为Tris-甘氨酸，pH8.3。用微量注射器分别取样品液25 μL，注入样品槽底部，点样结束后向上槽内加入1滴溴酚蓝指示剂示踪。起始电压控制在120 V，样品进入分离胶后，电压调整为200 V，待指示剂距前沿约1 cm时，停止电泳，迅速取出胶板，标记前沿。

　　1.3.10染色和脱色取出胶板后，用蒸馏水冲洗，随即放入考马斯亮蓝 R250显色液中，置恒温箱中38 ℃染色2 h 后取出，多次更换脱色液(甲醇10 mL、冰醋酸10 mL和蒸馏水80 mL)，至背景清晰为止。拍照、记录。