抗TNF-α单克隆抗体治疗豚鼠分泌性中耳炎的实验研究
【摘要】 目的：观察抗TNF-α单克隆抗体对豚鼠分泌性中耳炎的效果。方法：建立分泌性中耳炎的动物模型，随机分成空白对照组、造模组和TNF-αMcAb治疗组三组。比较光镜和电镜下中耳、咽鼓管粘膜的组织形态及处理组TNF-α蛋白含量变化。结果：TNF-αMcAb治疗组中耳、咽鼓管粘膜的组织形态接近于正常对照组，其TNF-α蛋白含量明显低于造模组（p<0.001）。结论：抗TNF-α单克隆抗体能拮抗TNF-α的炎症介导作用，对豚鼠分泌性中耳炎治疗有效。
【关键词】 中耳炎伴渗出液； 肿瘤坏死因子-α； 单克隆抗体； 动物模型
分泌性中耳炎(otitis media with effusion,OME)是儿童常见病、多发病，其发病机理虽有大量研究，但至今仍未充分阐明。近年来细胞因子在OME发病中的作用得到阐述与证明［1］。TNF-α作为前炎症细胞因子，引起中耳局部细胞因子的构建，造成耳及咽鼓管组织炎症损伤，并导致炎症迁延不愈。抗TNF-α单克隆抗体（TNF-αMcAb）通过拮抗TNF-α的炎症介导作用，已被运用于因TNF-α过量产生而导致的炎症、损伤等疾病的预防和治疗［2］。我们将TNF-αMcAb注入OME豚鼠的中耳腔，观察其对中耳、咽鼓管粘膜组织形态的影响及TNF-α蛋白表达的变化，以期获得一种新的治疗途径。
1 资料与方法
1.1 实验动物及分组：白色豚鼠由广东医学院实验动物中心提供，体重250～300g，共52只，普通级，雌雄兼用。将实验动物随机分为三组：空白对照组，4只（8耳）；OME造模组，24只（24耳）；TNF-αMcAb治疗组，24只（24耳）。
1.2 模型建立：豚鼠OME模型建立参照Jeon等［3］造模法,将豚鼠置于专制的豚鼠固定盒内，头颈露于盒外，耳显微钳清理外耳道，耳内窥镜检查后，75%酒精消毒外耳道，电耳镜暴露鼓膜，直视下鼓膜前下方穿刺向鼓室内注射2mg/kg铜绿假单胞菌LPS溶液（购自武汉博士德公司）50μL。TNF-αMcAb治疗组在SOM模型建立同时将TNF-αMcAb（购自武汉博士德公司）5mg注入中耳腔。豚鼠分别在造模后1、3、7、14、21、28d断头快速处死（造模组和TNF-αMcAb治疗组每次处死4只，空白对照组在28d统一处死），取大鼠双侧中耳粘膜及咽鼓管组织分成两部分，一部分30mg 组织放入0.2ml无水乙醇的匀浆器中制成匀浆，44℃1200r/min离心20min，取上清液酸化，再离心后取上清液，放置-40℃冰箱中保存待测。另一部分用10%的甲醛和25%戊二醛溶液灌注固定，制作光镜和电镜标本，光镜、扫描电镜观察。
1.3 TNF-α蛋白表达：采用放射免疫法测定TNF-α蛋白含量。按试剂盒说明书的步骤进行操作，TNF-α放射免疫试剂盒购自北京东亚免疫技术研究所，放射免疫计数器购自美国PE公司。
1.4 统计学方法：采用SAS8.12软件进行统计分析，运用成组设计t检验进行组间差异的比较。
2 结果
2.1 组织形态学检查
2.1.1 正常对照组：光镜下咽鼓管粘膜层薄，纤毛排列整齐。电镜下咽鼓管近鼓室段纤毛细胞的纤毛排列整齐，朝向鼻咽侧。
2.1.2 OME造模组：光镜下咽鼓管粘膜层增厚，腺体增生，粘膜表面有无结构的红染物覆盖。电镜下与正常对照组相比，咽鼓管纤毛细胞的纤毛排列紊乱，可见杯状细胞。
2.1.3 TNF-αMcAb治疗组：光镜下与造模组相比，咽鼓管粘膜层变薄，纤毛排列稍紊乱。电镜下与造模组相比，咽鼓管纤毛细胞的纤毛排列较有序，纤毛朝向鼻咽侧。
2.2 TNF-α蛋白的表达：OME造模组和TNF-αMcAb治疗组TNF-α蛋白含量的变化见表1。OME造模组TNF-α蛋白的表达在造模后第1d出现一小高峰，之后在7d又逐渐上升，在第14d达到高峰，21、28d仍保持高表达。TNF-αMcAb治疗组TNF-α蛋白含量的变化曲线与造模组相似，但14d后维持于较低水平。两组间不同时间的TNF-α蛋白含量的均数比较均有显著的统计学意义， TNF-αMcAb治疗组TNF-α蛋白表达明显低于OME造模组。
表1 OME造模组与TNF－αMcAb治疗组TNF-α蛋白含量的变化（略）
3 讨论
近年来许多研究表明, 分泌性中耳炎存在免疫功能紊乱，并与体内多种炎性介质或细胞因子有密切关系［1］。TNF-α主要由巨噬细胞和活化的T细胞产生，细菌脂多糖、内毒素、病毒可诱导其产生。TNF-α为前炎症细胞因子，构成炎性反应的急性期，使免疫系统快速进入活性状态，并促使其它细胞因子释放，引起中耳粘膜水肿、血管扩张、抑制纤毛运动及促使上皮过度增生。临床检测已经证明，OME患者中耳积液中TNF-α的含量明显增高，且与病情的反复及迁延相关［4,5］。Smirnova等［6］的研究还发现，TNF-α可在体内激活一氧化氮合成酶增加氧的合成，后者通过升高粘膜上皮细胞内环磷酸腺苷的浓度使粘蛋白分泌增多，促进粘蛋白的生成，过量粘蛋白的分泌会增加粘液毯和中耳积液的粘滞度, 妨碍中耳积液的清除，导致粘液性分泌性中耳炎患者病情持续。
本实验通过向中耳腔注入铜绿假单胞菌脂多糖制作分泌性中耳炎动物模型，运用放射免疫法测定TNF-α的蛋白含量，观察TNF-α在分泌性中耳炎急性期不同时间的表达变化，发现TNF-α蛋白的表达在造模后第1d出现一小高峰，之后在第7d又逐渐上升，在第14d达到高峰，第21、28d仍然保持在较高水平。考虑为脂多糖中耳腔注入后，激活单核巨噬细胞产生TNF-α等多种细胞因子，这些炎症介质引起炎症细胞聚集、血管扩张、通透性增加，导致产生中耳积液。后期（>14d）则通过各种炎症因子的相互促进或抑制，形成细胞因子，而致使炎症反应持续，影响OME的痊愈或持续迁延［1］。
TNF-αMcAb作为一种已获准临床应用的细胞因子免疫调节剂，通过封闭TNF-α分子上多个与细胞毒性相关的部位，阻止TNF-α与受体结合，抑制TNF-α介导的各种免疫细胞功能以及由此而引发的各种毒副损害，并加速机体对TNF-α的清除。已有大量的动物实验证据和一些临床试验表明，抗TNF-α单克隆抗体能够预防和因TNF-α过量产生而导致的炎症、损伤等疾病状态［2］。我们利用TNF-αMcAb中耳腔注入，观察其对分泌性中耳炎的疗效。通过中耳、咽鼓管粘膜的组织形态的比较，显示TNF-αMcAb预处理后有利于炎症的良性转归。通过两处理组TNF-α蛋白含量的比较，发现在急性期不同时间TNF-αMcAb治疗组TNF-α蛋白的表达均明显减少，并在后期仍能保持在较低的表达水平，显示McAb可拮抗TNF-α炎症介导作用，降低中耳局部的炎症反应，促进疾病的治愈。
目前TNF-αMcAb运用于预防和治疗因TNF-α过量产生而导致的炎症、损伤等疾病的治疗途径仅是对其环节中一个靶位进行治疗，特别是其远期疗效尚难预料，需要进一步论证。我们的实验就其中耳腔注射治疗豚鼠分泌性中耳炎进行观察有效，但是就TNF-αMcAb对临床患者的疗效还有待下一步的实验证实。
【】
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