葛根素对鼠肝微粒体细胞色素P450的影响
【摘要】 目的：观察葛根素对鼠肝微粒体细胞色素P450（CYP）的影响。方法：实验动物分别腹腔注射生理盐水、苯巴比妥（40mg/kg.d）、葛根素（100和200 mg/kg.d），给药7d后，用分光光度法测定肝微粒体CYP和细胞色素b5(Cytb5)的含量，以及苯胺羟化酶（ANH）和氨基比林N-脱甲基酶（ADM）的活性。结果:苯巴比妥和葛根素均能显著缩短戊巴比妥钠对小鼠的催眠时间，显著提高小鼠肝脏指数、CYP含量，以及大鼠CYP和Cytb5含量，且以苯巴比妥组更为显著。苯巴比妥能非常显著地提高大鼠ANH和ADM活性，葛根素仅提高ADM活性，对ANH无明显影响。结论:葛根素对小鼠和大鼠肝微粒体CYP有诱导作用，但诱导能力显著弱于苯巴比妥。
【关键词】 葛根素 苯巴比妥 细胞色素P450 苯胺羟化酶 氨基比林N-脱甲基酶
Abstract: Objective: To observe the effects of puerarin on the hepatic cytochrome P450(CYP) in mice and rats. Mehtod: The animals were given intraperitoneally normal saline(10ml/kg.d), phenobarbital (40mg/kg.d) and puerarin (100, 200mg/kg.d) respectively for seven days. Then the levels of hepatic microsomal CYP and cytochrome b5(Cytb5), and the activities of aniline hydroxylase(ANH) and aminopyrine N-demethylase(ADM) were determined by spectrophotography. Result: Both phenobarbital and puerarin shortened obviously the hypnotic duration of pentobarbital sodium, increased the liver indexes and CYP levels in mice as well as the contents of CYP and Cytb5 in rats. Phenobarbital could enhance significantly the activities of ANH and AHM in rats, but puerarin could only enhance the activity of ADM. Conclusion: Puerarin showed induction effect on the hepatic microsomal CYP in mice and rats, which would be not so obvious as that of phenobarbital.
Key words: Puerarin; Phenobarbital; Cytochrome P450; Aniline hydroxylase; Aminopyrine N-demethylase
葛根素（puerarin）是豆科植物葛根的主要有效成分，属异黄酮类，具有扩张血管、抑制血小板聚集、降血压、降血糖、改善微循环、提高冠脉及脑血流量等作用，广泛用于心脑血管疾病的防治［1］。目前，联合用药日益普遍，使药物间的相互作用倍受重视。肝微粒体细胞色素P450（cytochrome P450,CYP）是药物代谢的最重要酶系，药物对CYP活性的影响，是药物间相互作用的最重要机制。为了解葛根素对动物肝微粒体CYP活性的影响，特进行本实验，报道如下。
1 实验材料
1.1 药品与试剂：注射用葛根素，北京四环科宝制药有限公司，批号020922，每支100mg，实验时用生理盐水溶解，配成所需浓度供实验用；戊巴比妥钠，医药集团上海试剂公司分装，批号F20020405；苯巴比妥钠，上海新亚药业公司，批号010202；牛血清白蛋白，上海伯奥生物科技有限公司，批号2000C801；辅酶Ⅱ（NADPH），上海丽珠东风生物技术有限公司；一氧化碳（CO）为本室自制。联二亚硫酸钠（保险粉）、氨基比林、盐酸苯胺、4-氨基酚、甲醛、乙酰丙酮等为国产分析纯。
1.2 动物：昆明种小鼠，体重18～22g,♀♂各半；Wistar大鼠，♂，体重200～230g，均购自山东大学实验动物中心，实验动物质量合格证：鲁动质字20021024。
1.3 仪器：GL-20G-Ⅱ型高速冷冻离心机，上海安亭仪器厂；S-54型紫外可见分光光度计，上海棱光技术有限公司；AR1140/C分析天平，奥豪斯国际贸易上海有限公司。
2 方法与结果
2.1 葛根素对戊巴比妥钠催眠作用的影响：取小鼠60只，随机分为4组，每组15只，分别腹腔注射（ip）生理盐水、苯巴比妥钠40 mg/kg、葛根素100mg和200mg/kg， 每日1次，共7次。在末次给药24h后，各组小鼠均ip戊巴比妥钠50 mg/kg，以小鼠翻正反射消失和恢复作为“入睡”和“苏醒”的指标，戊巴比妥钠对小鼠的催眠潜伏期（从ip戊巴比妥钠至翻正反射消失的间隔时间）和催眠时间（从翻正反射消失至恢复的间隔时间）。
结果显示，各组小鼠ip戊巴比妥钠后，大多数在8min内翻正反射消失，进入睡眠状态，各组催眠潜伏期无显著性差异。但苯巴比妥组和200mg/kg葛根素组分别有8只和3只小鼠在ip戊巴比妥钠后仅表现为共济失调和自发活动减少，40min内翻正反射一直未消失，视为“未催眠”，催眠时间以“0”计，不记录催眠潜伏期。两葛根素剂量组戊巴比妥钠的催眠时间显著缩短，但缩短程度小于苯巴比妥组。见表1。表1 连用7d葛根素对小鼠苯巴比妥钠催眠时间的影响（略）
2.2 葛根素对小鼠肝脏指数和肝CYP含量的影响：取小鼠40只，随机分物为4组，每组10只，给药剂量和方法同2.1。动物经禁食过夜，在末次给药24h后，称重，断头处死，放尽血液并迅速剖开腹腔和胸腔，剪开心脏，用冰冷生理盐水冷却冲洗肝脏并取出，除尽血污，称肝重，计算肝脏指数。剪碎肝脏，加冰冷的15%甘油-20mmol/L磷酸盐缓冲液（匀浆缓冲液，pH7.4），制成20%组织匀浆。匀浆液离心（2℃，10 000×g）30min，取上清液即得肝微粒体（MS），即S9部分［2］。用双缩脲法测定MS蛋白质含量。
CYP含量的测定方法：精密量取MS悬液0.2ml, 加匀浆缓冲液2.3ml，置入比色杯中，加数克保险粉，扫描400～500nm间基线（调零）后，通入CO约1min，再于400～500nm波长范围内扫描测定，记录450nm及490nm处吸光度（A）。按下式计算CYP含量［2］：
CYPnmol/mg蛋白=（△A450－490×1 000）/（91×蛋白质浓度）
各组小鼠连续给药7d前后的体重变化均无明显差异。100和200mg/kg的葛根素均能显著提高小鼠肝CYP含量，且高剂量组小鼠的肝脏指数亦见显著提高，但其提高程度均小于苯巴比妥组，P＜0.01。结果见表2。表2 连用7d葛根素对小鼠肝脏指数及CYP含量的影响（略）
2.3 葛根素对大鼠肝CYP和细胞色素b5含量的影响：取大鼠41只，随机分为4组，分别给予生理盐水、苯巴比妥钠40 mg/kg、100和200 mg/kg葛根素，ip，每日1次，共7次。动物经禁食过夜，在末次给药24h后，断头处死，开腹后迅速用冷生理盐水经肝门静脉灌洗肝脏至土黄色，摘取肝脏，滤纸吸干水分，剪碎肝组织并称重，加匀浆缓冲液，制成20%组织匀浆。MS制备、蛋白质及CYP含量测定同2.2。
细胞色素b5（cytochrome b5, Cytb5）测定方法：精密量取MS悬液0.2ml, 加匀浆缓冲液2.3ml，置入比色杯中，首先扫描400～500nm间基线（调零），然后在比色杯中再加入数 mg保险粉，再于400～500nm波长范围内扫描，得到还原型Cytb5的吸收光谱曲线，记录424和490nm处A值。按下式Cytb5含量［2］：
Cytb5nmol/mg蛋白=（△A424－490×1 000）/（171×蛋白质浓度）
结果显示，葛根素两剂量组大鼠肝CYP和Cytb5含量均见显著增加，尤以CYP含量的增加更为显著，但增加程度低于苯巴比妥组，P＜0.01。见表3。表3 连用7d葛根素对大鼠肝微粒体苯胺羟化酶和氨基比林N-脱甲基酶的影响（略）
2.4 葛根素对大鼠肝微粒体苯胺羟化酶和氨基比林N-脱甲基酶活性的影响：取步骤2.3制备的大鼠MS悬液，用匀浆缓冲液稀释至蛋白质浓度在10mg/ml左右。参照方法［2］，测定苯胺羟化酶（aniline hydroxylase ,ANH）和氨基比林N-脱甲基酶（aminopyrine N-demethylase , ADM）的活性，苯胺和氨基比林的终浓度分别为2.5和0.4mmol/L。
结果见表3。与生理盐水组相比，两葛根素组ANH活性未见明显变化，但能显著提高ADM活性。苯巴比妥组ANH和ADM活性均见显著升高，且明显高于两葛根素组，P＜0.01。
3 讨 论
CYP是由结构和功能相关的基因超家族编码的同工酶所组成的超家族酶系，是肝微粒体中最重要的混合功能氧化酶，参与大量的外源性物质（药物、化学毒物、致癌物等）和内源性物质（类固醇激素、维生素D、胆酸等）的代谢过程；而CYP本身又可被许多物质诱导或抑制，是造成药物间相互作用的最重要原因［3］。戊巴比妥钠主要经CYP代谢而灭活，催眠时间长短直接反映戊巴比妥钠在体内代谢速度的慢或快，对其催眠作用的影响可间接反映对CYP活性的影响。实验发现，葛根素连续给药7d后，能显著缩短戊巴比妥钠对小鼠的催眠时间，增加小鼠肝脏系数和肝CYP含量，提高大鼠肝CYP和Cytb5含量，并呈剂量依赖性，提示葛根素对鼠肝微粒体CYP有诱导作用。
已有资料表明，葛根总黄酮能提高大鼠肝匀浆的S9部分CYP总量，呈诱导活性［4］。本实验进一步表明，作为葛根总黄酮的最主要组分葛根素，在显著提高CYP总量的同时也使Cytb5的含量升高，并显著增加ADM活性，但对ANH无明显影响。在CYP超家族中，CYP2是最大、最复杂的家族，占肝CYP总量的35%，代谢约50%的临床用药［5］。ANH是CYP2E1的标志酶，但ADM特异性不高，主要反映CYP2A、2B和2C亚家族中能进行脱甲基化反应的同工酶活性，如2A2、2B1、2B2、2C11等［5］。本实验中苯巴比妥较葛根素能更大程度地提高ADM活性，同时ANH活性亦见升高，提示二者对CYP2家族有诱导作用，葛根素诱导作用弱，但特异性较苯巴比妥高。
CYP2E1不但参与部分药物的代谢，而且还能催化许多前致癌物和毒物的活化过程。人和动物的CYP2E1活性十分相似，且底物都是相同的。实验结果表明，葛根素对CYP2E1未呈诱导作用，则不促进由CYP2E1介导的前致癌物和毒物的活化，但对CYP2A、2B、2C等可能呈诱导作用，由此可能产生药物的相互作用，在临床上应给予足够的重视。CYP1家族尤其CYP1A1是重要的前致癌物活化酶，CYP3家族尤其CYP3A4参与约30%临床药物的代谢，葛根素对其活性的影响，有必要进行深入研究。
【文献】
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