人CTLA-4Ig腺病毒载体的构建鉴定与表达

             作者：冯宁翰　张炜　吴军　眭元庚　钱立新　华立新　贺伟峰　宋宁宏　吴宏飞

【关键词】  CTLA-4Ig

　　摘要：目的：运用PAdEasy系统构建了带荧光蛋白的人CTLA-4Ig腺病毒载体，为进一步研究CTLA-4Ig诱导免疫耐受的机制奠定了基础。方法：采用基因技术，将目的基因克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中，利用PAdEasy系统进行重组，然后在293细胞中进行扩增。并进行病毒滴度测定。体外感染人肾小管上皮细胞。结果：酶切鉴定和PCR证明重组人CTLA-4Ig腺病毒载体构建正确。结论：应用PAdEasy细菌内重组技术成功构建了人CTLA-4Ig带荧光腺病毒载体。

　　关键词：腺病毒;CTLA-4Ig;同源重组　

　　The Express and Recombinant of Adenovirus of Human CTLA-4Ig Gene

　　Abstract: Objective: To construct the recombinant adenovirus of human CTLA-4Ig gene .Method: The CTLA-4Ig gene was cloned into the shuttle plasmid pAdTrack-CMV to form the transfer vector by the method of homogenous recombination.Result: It is confirmed that the CTLA-4Ig gene were inserted successfully into the adenovirus by using restriction  endonuclease and PCR analyses .Conclusion: The recombinant adenovirus of human CTLA-4Ig gene was successfully constructed.

　　Key words:Adenovirus；CTLA-4；Homogenic reconstruction
                                                             
　　器官移植是许多终末期疾病的唯一有效方法。但移植后的排斥反应是影响移植物功能与存活的最大的障碍。研究表明，T细胞的活化是引起急性排斥反应的最主要因素。CD28/ CTLA-4-B7是T细胞活化中重要的共刺激通道。阻断B7与CD28的结合，可以使移植物生存时间延长。CTLA-4存在于活化的T表面，是一种负调性的因子。它可以竞争性的阻断B7-CD28通路［1］。我们应用PAdEasy系统，构建了带荧光的CTLA-4Ig腺病毒载体，为研究B7-CD28在诱导免疫耐受中的作用奠定了良好的基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料：质粒和菌种：人CTLA4-Ig质粒由第三军医大学烧伤研究所保存，BJ5183菌株，Adeasier-1细胞，含绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein,GFP）的穿梭质粒pAdTrack-CMV,腺病毒基因组质粒PAdEasy-1购自美国Stratagene 公司。293细胞购自美国ATCC公司。

　　1.2 试剂：Hid iii,XbaI,限制性内切酶，T4 Ligase，TaqDNA聚合酶，DNA回收试剂盒购自Takara公司，质粒DNA提取盒购自Omiga公司， DMEM购自Hyclone公司，PCR试剂盒为Promega公司产品，PCR引物由上海生物化学工程公司合成。

　　1.3 腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-CTLA4-Ig的构建：腺病毒载体质粒pAdTrack-CMV和CTLA4-Ig分别进行酶切提取DNA。用Hid iii单切pAdTrack-CMV后，再用XbaI酶切。Hid iii和XbaI酶双切pCTLA4-Ig质粒,通过0.8%的琼脂电泳，分别回收pAdTrack-CMV和CTLA4-Ig的片段，两者的分子量分别为9.2Kb和1.4Kb。用T4 Ligase酶连接两者。钙转化大肠杆菌DH5α，挑选转化菌落，PCR筛选，提取质粒。酶切鉴定。

　　1.4 重组腺病毒质粒载体pAdEasy-1 -CTLA4-Ig的构建与鉴定。取25ｕl pAdTrack-CMV-CTLA4-I用PmeI 酶切线性化，然后去磷酸化，电转Adeasier-1细胞行同源重组（2500V，200Ohm,25ｕF）LB培养基37℃培养60min，涂于卡那抗性板，过夜。手工提取转化菌落，根据电泳的质粒分子量，初步筛选出阳性重组体，再根据PCR和酶切鉴定，提取阳性克隆。转至XL10-GOLD细菌，用PCR和酶切鉴定，正确。

　　1.5 重组腺病毒的包装和扩增：pAdEasy-1 -CTLA4-Ig质粒DNA经酶切和酚-氯仿抽提后，经酶切，酚-氯仿抽提，乙醇沉淀后，用脂质体2000转染293细胞。转染时，先用混合液滴加到漂洗过的293细胞中，6h后换成完全培养基DMEM。转染后24h转移到一次性塑料培养瓶。然后在不同的时相点在荧光显微镜下观察荧光蛋白的表达情况。转染后12d，可见50%的细胞都表达荧光。d14，待部分细胞悬浮，收集细胞。-20℃和37℃反复冻融三次，离心后收集上清。用收集的上清再感染293细胞，大量扩增腺病毒。将收集的病毒液用氯化铯密度剃度离心法纯化。

　　1.6 滴度测定：根据CPE法来样品滴度［2］。按下列公式计算样品滴度：样品滴度（PFU/ml）=稀释倍数×稀释度（CPE阳性细胞孔数-4）/8=106 × 3（CPE阳性细胞孔数-4）/8。

　　1.7 病毒体外感染人体细胞的效率：2×106的HK细胞接种于6孔板，在细胞融合至80%时，按感染倍数为10：1，50：1，100：1加入腺病毒上清。培养24h，48h分别观察荧光细胞数。

　　2 结果

　　2.1 腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-CTLA4-Ig的鉴定：Hid iii和XbaI酶切腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-CTLA4-Ig，0.8%的琼脂电泳可见大小分别为 9.2 kb和1.2kb的片段，见图1。

　　图1 略

　　2.2 重组腺病毒质粒载体pAdEasy-1 -CTLA4-Ig的鉴定：PAdEasy-1-CTLA-4Ig经P meI酶切以后，重组质粒可以产生一个30kb 和4.5 kb的特征性的条带而确定，见图2。

　　2.4 重组腺病毒的产生和扩增：pAdEasy-1 -CTLA4-Ig经脂质体转染293细胞后14h即可见荧光蛋白的表达，随时间的延长表达荧光蛋白的细胞数量增加，在转至培养瓶后，荧光蛋白的细胞数量继续增加。到d12时候，部分细胞悬浮，在此期间少量加液。d14在细胞全部悬浮后收集液体。感染后48h的图象如下，见图3。

　　图2 － 图3   略

　　2.5 体外重组腺病毒对人体肾小管上皮细胞的感染效果。用不同的感染倍数来感染人体肾小管上皮细胞，发现当MOI为100：1时，24h后70%的肾小管上皮细胞即表达GFP荧光蛋白，48小时后100%的细胞即表达GFP荧光蛋白。当MOI为50：1时，48h后90%的肾小管上皮细胞即表达GFP荧光蛋白。当MOI为50：1时，48h后70%的肾小管上皮细胞即表达荧光蛋白。这说明我们构建的CTLA4-Ig重组腺病毒载体是高效的，可以在目标细胞中高效表达，见图4。

　　图4    略

　　3 讨论

　　T细胞的活化是引起移植物排斥反应的最主要的因素。最新的研究表明，T细胞的活化需要双信号。即由TCR和供体MHC-抗原组成的第一信号是抗原特异性的。第二信号由T细胞与APC细胞上的共刺激分子结合而传递。第二信号是抗原非特异性的，但是它对于T细胞的活化却是必需的。如果缺少了第二信号，则T细胞就会发生凋亡，无能或者是“激活”状态的耐受。因此，阻断T细胞与APC细胞上的共刺激分子的结合，就能诱导T细胞的低反应性。B7-CD28和CD40-CD154是最重要的共刺激分子［1］。新近的研究表明，阻断它们之间的通路，可以使移植物存活时间延长，可以诱导T细胞产生供者特异性的无反应性［3～6］。

　　细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）是与CD28序列非常相似的一种T细胞表面分子，存在于活化的T细胞的表面，CTLA-4起负调作用，它可以抑制T细胞的活化。它与B7家属的结合力比CD28要大20倍到50倍，因此它可以与CD28竞争性结合B7,能与CD28竞争性结合B7，阻断B7-CD28共刺激通路,从而特异性地阻断CD28-CD86共刺激分子通道，从而诱导T细胞的凋亡和无能［7，8］,延长移植物的存活时间。因此，它被认为是诱导移植耐受的最有希望的物质。

　　通过基因技术来诱导针对移植物的特异性的耐受是当前免疫与移植界的热点。人们期望通过载体的介导来封闭共刺激分子通道，从而使移植物免受受体的T细胞的攻击。CTLA-4Ig作为一种重要的负调因子，通过封闭CD28-CD86通道，可以使移植物存活延长。但有效的基因转移方法是决定效果的关键。我们设想通过构建病毒载体，使之产生CTLA-4Ig。目前使用的载体主要有以下几种：病毒载体，质粒，脂质体等。在病毒载体中，又包括腺病毒，逆转录病毒等。脂质体毒性大，对细胞的损伤大，一般仅作为一种辅助手段。而逆转录病毒虽然可以整合到宿主的染色体中，从而长时间地表达所负载的目的，但它的转染效率很低，直接影响到效果。腺病毒载体具有一些特有的优点：它很少发生插入突变，操作很方便，它的宿主的范围很广，可以感染的细胞的种类很多，而且它可以携带大片段的外源目的基因，在科研方面有重要意义。另外，腺病毒载体可以表达接近翻译后成熟水平的蛋白质。因此，它已经成为了基因治疗中重要的工具。因此我们利用腺病毒作为载体来构建。我们使用的 pAdEasy腺病毒载体是一种更为有效的细菌内重组系统，方便，高效。与传统的腺病毒载体相比，它可以在短期内获得大量的含目的基因的质粒，而且所获得的病毒滴度高。另外，它携带有荧光基因，在与目的基因连接后能在细胞中产生荧光。正是它的这些优点，可以很方便观察转染的效果和感染效率。与我们以前合成的逆转录病毒CTLA-4相比，它具有极大的优点。

　　我们成功构建了携带CTLA-4Ig基因的腺病毒载体。经酶切和PCR证明是正确的。病毒的滴度较高，实验证明它可以高效感染目的细胞。为我们以后做CTLA-4Ig在诱导移植肾免疫耐受打下了良好的基础。

　　：

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　　［3］Kenyon NS, Chatzipetrou M, Masetti M, et al. Long-term survival and function of intrahepatic islet allografts in rhesus monkeys treated with humanized anti-CD154［Ｊ］. Proc Natl Acad Sci USA， 1999，96:8132-8137.

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