多药耐药相关蛋白2在乳腺癌组织中的表达及与预后关系
【关键词】 乳腺肿瘤；基因；MDR；多药耐药相关蛋白
［摘要］ 目的：研究多药耐药相关蛋白2(Multidrug resistanceassociated protein 2，MRP2)在乳腺癌组织中的表达，评估其在乳腺癌预后中的作用。方法：采用免疫组织化学方法（Immuno Histo Chemistry，IHC）检测47例手术切除的乳腺癌组织中MRP2的表达，并分析其与临床、病理特征的关系及对预后的影响。结果：MRP2在乳腺癌组织中的阳性表达率为85.1%(40/47)，其中高表达者25例(53.2%)；MRP2表达与月经状况、肿瘤大小、腋淋巴结转移、组织分级和激素受体状况均无关（P>0.05）；KaplanMeier生存分析结果表明MRP2表达与无病生存期和总生存期均无关(P>0.05)；COX多因素分析显示只有肿瘤大小和腋淋巴结转移和无病生存期和总生存期明显相关(P<0.05)。结论：MRP2在乳腺癌组织中具有一定的表达水平，但与乳腺癌患者预后无关。
［关键词］ 乳腺肿瘤；基因；MDR；多药耐药相关蛋白2；预后
The Prognostic Significance of Multidrug Resistanceassociated Protein 2 Expression in Primary Breast Carcinoma
Abstract：Objective Intrinsic and/or acquired resistance was the major obstacle to overcome in the treatment of patients with breast cancer.The aim of the present study was to investigate the relationship between the expression of multidrug resistanceassociated protein 2 (MRP2) with the clinicpathologic characteristics and the prognosis in primary breast cancer patients.Methods Expression of MRP2 in 47 breast cancer patients was determined by immunohistochemistry on formalinfixed，paraffinembedded tumor section.Results MRP2 expression was observed in 40 of 47(85.1%).No relation can be established between expression of MRP2 and other clinicopathologic parameters.KaplanMeier analyses revealed that MRP2 expression didn't associated with diseasefree survival (DFS) or overall survival (OS) (P>0.05).In multivariate Cox regression analysis，tumor size and lymph node metastasis was independent prognostic factors for survival (P<0.05).Conclusion Our results suggested that MRP2 is frequently expression in primary breast cancer，but MRP2 is not a poor prognostic factor in patients with breast cancer.
Key words：Breast carcinoma;Gene;MDR;Multidrug resistanceassociated protein 2(MRP2);Prognosis
对化学（化疗）耐药是导致乳腺癌治疗失败的主要原因之一，国内外研究表明，肿瘤耐药涉及细胞内药物浓度降低、药物靶分子改变、代谢解毒、DNA损伤修复功能增强等多种机制，与多种耐药相关基因有关，由MRP2介导的耐药是除P糖蛋白(Pglycoprotein，PGP)外的一个重要耐药机制［1］。本研究采用免疫组织化学方法检测MRP2在乳腺癌组织中的表达，以评估其在判断乳腺癌预后中的作用。
1 材料与方法
1.1 患者资料
本组47例标本选自深圳市人民1992年至1994年间，经病理证实且有随访和预后资料的女性乳腺癌患者。所有病例在诊断时无远处转移证据并给予手术切除，标本经10%中性甲醛固定，石蜡包埋，连续制成4 μm厚切片若干张，分别进行HE和IHC染色。
1.2 组化试剂
一抗为鼠抗人MRP2单克隆抗体M2Ⅲ6(IgG1，1∶10)，为荷兰Monosan公司产品，SP和DAB试剂盒为美国Zymed公司产品。分别用已知的正常组织或肿瘤组织阳性片作阳性对照，用10%正常动物血清代替一抗作阴性对照。
1.3 染色步骤
石蜡切片常规脱蜡、水化；加3%过氧化氢甲醇溶液50 μl阻断过氧化物酶后，加热修复抗原10 min；加10%正常山羊血清50 μl封闭，室温孵育10 min；加第一抗体，室温孵育60 min；加生物素标记的第二抗体50 μl，室温孵育10 min；加辣根酶标记的链霉卵白素溶液50 μl，室温孵育10 min；加新鲜配制DAB溶液100 μl显色，显微镜下观察3 min～10 min。以上各步骤之间均用缓冲液冲洗3次，共15 min，苏木素复染、脱水、透明、封片，镜下观察。
1.4 结果判断
由两位免疫组化室的病理医师在不知道任何临床和病理资料的情况下对免疫组化染色进行评估，根据肿瘤细胞染色程度分阴性(-)、弱阳性(+)、中等阳性(++)和强阳性(+++)四级，将(-)和(+)归为低表达组，(++)和(+++)归为高表达组。
1.5 统计方法
生存期的是从手术日期起到随访日期或由于复发、转移而死亡的日期为止。用SPSS 10.0统计软件进行统计分析MRP2，和临床病理特征的关系采用卡方检验或Fisher's精确概率法，KaplanMeier法计算生存曲线并用Log rank test比较，预后分析采用单因素和多因素Cox回归模型。
2 结果
2.1 MRP2在乳腺癌组织内的表达
MRP2阳性表达部位主要出现在细胞浆和细胞膜，呈棕黄色颗粒状，弥漫或散在分布(见图1)，此外MRP2在某些间质细胞也可呈阳性表达，本组乳腺癌组织标本中阴性(-)7例、弱阳性(+)15例、中等阳性(++)20例和强阳性(+++)5例，总阳性率为85.1%(40/47)，低表达者占46.8%(22/47)，高表达者占53.2%(25/47)。
2.2 MRP2表达与临床病理特征的关系
MRP2表达与月经状况、肿瘤大小、腋淋巴结转移、组织分级和激素受体状况均无关（P>0.05），见表1。表1 47例乳腺癌MRP2表达与临床病理特征的比较（略）
2.3 MRP2表达与生存期的关系
KaplanMeier生存分析结果表明(见图2): MRP2表达与无病生存期明显相关(P=0.930 0)和总生存期无关(P=0.655 6) 差异均无显著性，即MRP2高表达组与低表达组的无瘤生存期和总生存期相比较并无缩短。
2.4 MRP2表达与预后的关系
COX多因素分析显示肿瘤大小和淋巴结转移与无瘤生存期及总生存期（P<0.05）均明显相关，而MRP2表达与无瘤生存期及总生存期均无关， 由此可见，肿瘤大小和淋巴结转移仍是影响乳腺癌预后重要的预后因子，见表2。
3 讨论
肿瘤耐药是多基因参与的结果，了解耐药基因的表达，不仅对于选择合适的方案和实施有效的逆转措施具有重要的指导意义，而且耐药蛋白作为一种新型预后标志也引起人们的普遍关注。已有研究表明MRP2可能与肝癌、肺癌、白血病和卵巢癌等预后有关［2～5］，然而其在乳腺癌中是否与预后有关还不十分清楚。MRP家族是一组阴离子有机物转运蛋白，属ABC超家族膜转运蛋白成员，依赖水解ATP所产生的能量将阴离子结合物及部分药物转运到细胞外。据目前报道MRP家族至少有7名成员（MRP17），MRP2最早在大鼠肝克隆成功，主要表达于肝管的细胞膜上，还有肾刷缘细胞膜和小肠上皮细胞，基因定位于10q24，编码有1 545个氨基酸残基膜糖蛋白，MRP2有一个和MRP1相似的GSH结合区，所以一样能够转运抗癌药物，基因转染实验证明MRP2可导致对MTX、顺铂、长春新碱、阿霉素、喜树碱类和米托蒽醌等抗癌药物耐受，由于对顺铂耐药与MRP1不同，而引起学者广泛关注［6］。我们此前曾报道MRP1在乳腺癌组织中的表达及与预后的关系［7］，而其他成员包括MRP2在乳腺癌中的表达和临床意义目前国内尚未见报道。表2 47例乳腺癌预后因素的COX模型分析结果（略）注：RR值为暴露组发病率与非暴露组发病率的比值；95%CI为RR值的95%可信区间。
Sandusky等［8］报道采用两种MRP2抗体检测组织芯片中MRP2的表达，结果表明MRP2广泛在多种正常组织和肿瘤组织中，其中MRP2在22例肾癌中表达9例，13例胃癌中表达8例，32例肺癌中表达14例，50例结肠癌中表达39例，17例卵巢癌中表达16例，而其中49例卵巢癌中表达25例，乳腺癌患者的表达率为51.0%，本组研究中我们采用免疫组化方法MRP2本组总阳性率为85.1%，两者均显示乳腺癌组织MRP2具有相近的表达水平。本组研究显示MRP2表达和月经状况、肿瘤大小、腋淋巴结转移、组织分级和激素受体状况等临床病理特点均无关，这与大多数的研究相一致，而Sandusky等的研究发现在多种低分化肿瘤组织中呈现高表达，如结肠癌、肺癌、胃癌和卵巢癌，并且在组织学分级2级~3级的乳腺癌和肾癌中高表达，同时在良性肿瘤中MRP2却几乎无表达，由此推测MRP2表达可能与肿瘤的分化程度有关。Materna等［9］报道应用RTPCR方法检测61例卵巢肿瘤，其中50例卵巢恶性肿瘤中有15例表达MRP2，占30%，结果发现MRP2表达和总生存期无关。同样我们的研究也显示MRP2与无病生存期和总生存期均无关(P=0.044)，在多因素分析中最终也并未进入Cox回归模型中，MRP2高表达和低表达者生存期的差异不具有显著性。最近Burger等［10］也报告59例乳腺癌多种耐药基因的表达（BCRP/LRP/MRP1/MRP2/MDR1），结果显示只有MDR1表达与一线化疗呈负相关，而只有LRP和MDR1与无病生存期有关，而BCRP、MRP1和MRP2与无病生存期均无关。总之，我们的初步研究结果显示MRP2在乳腺癌患者中具有较高的表达率，但MRP2表达与乳腺癌患者预后无关，但有待于进一步积累资料证实。
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