荧光定量PCR检测乙型肝炎的临床研究

【关键词】  FQ

　　［摘  要］ 目的：探讨荧光定量聚合酶链反应(FQPCR)方法检测乙型肝炎的临床价值。方法：应用FQPCR技术对1 562例乙型肝炎阳性血清标本和无症状健康者血清进行HBVDNA检测并对不同血清型的HBVDNA进行比较。结果：经FQPCR检测,380例HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBcAb(+)其HBVDNA阳性率100%；246例HBsAg(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)其HBVDNA阳性率88.6%；210例HBsAg(+)、HBeAg(+)其HBVDNA阳性率98.1%；190例HBsAg(+)、HBcAb(+)其HBVDNA阳性率69.5%；146例HBsAb(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)其HBVDNA阳性率22.6%；66例HBsAb(+)其HBVDNA阳性率6.1%；20例HBsAb(+)、HBcAb(+)其HBVDNA阳性率60.0%；18例HBsAb(+)、HBeAb(+)其HBVDNA阳性率55.5%；286例“两对半”五项全阴性的病例中有4例HBVDNA阳性,其阳性率为1.4%。结论：血清中HBVDNA水平反映了体内HBV是否复制及复制的程度，定量PCR是鉴别HBV感染各期有价值的工具，是评价传染性的可靠方法。定量PCR测定灵敏度高，对乙型肝炎的临床诊断、方案的选择和疗效观察有重要意义。

　　［关键词］ FQPCR；HBVDNA；乙型肝炎病毒

　　Clinical Researchon Detection of Hepatitis Bvirusby Fluorescence Quatitative PCR

　　Abstract：Objective To set up aFluorescence QuatitativePCR assay to explore the clinical value of detecting the load of HBVDNA.Methods FQPCR technique was used to measure 1562 samples HBVDNA of thedifferent cases of hepatitis B and the cases of HBV antigen or antibodynegativeand tocomparewithits.Results Using ELISA as contrast,in 1562 clinical serum samples were tested.380 HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBcAb(+) samples,FQPCR were all positive,with 1.21×106～7.69×109 CP/mL.246 HBsAg(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+) samples,positive rate of 88.6%,with 1.01×104～9.08×106 CP/mL.210 HBsAg(+)、HBeAg(+) samples 98.1%,190 HBsAg(+)、HBcAb(+) samples 69.5%,286 with ELISA five indexes all negative samples there were4 HBVDNA positive,1.4%.66 HBsAb(+) samples 6.1%.146 HBsAb(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+) samples 22.6%.20 HBsAb(+)、HBcAb(+) samples 60%.18 HBsAb(+)、 HBeAb(+) samples55.5%.Conclusion FQPCR was an accurate quatitative technique in detecting HBVDNA and it was significant better than ELISA technique in diagnosis of hepatitis B and selection of antivirus drugs.FQPCR can be used to minitor the true state of HBV infection and amplification.It was importanttoclinical diagnoseand selecttreatmentandminitor forHBV.

　　Key words：FQPCR；HBVDNA；Hepatitis B Virus

    荧光定量PCR在保留PCR灵敏和特异的基础上进一步利用了分子杂交技术的特异性和光谱分析技术的灵敏性及可计量性，避免了常规PCR不能定量和污染造成假阳性的缺陷，成为常规PCR的更新换代技术，是目前最先进的PCR方法。本组采用荧光定量PCR技术对血清HBVDNA进行了临床研究，现报告如下。

　　1  材料与方法

　　1．1  研究对象 

　　2002年至2004年1 276例乙型肝炎阳性血清和286例全阴性血清标本。

　　1．2  仪器与试剂 

　　PE5700由美国PE公司生产FQPCR定量试剂盒由广州中山达安基因股份有限公司提供，酶免试剂由上海荣盛公司提供。

　　1．3  方法 

　　严格按操作说明书操作。

　　2  结果

　　对1 276例乙肝阳性血清标本和286例全阴性标本采用FQPCR检测，其结果如表1。表1  1 562例乙肝阳性和阴性血清标本PCR检测结果（略）

　　3  讨论

　　聚合酶链反应PCR从早期的斑点杂交法、bDNA法，到竞争性PCR、PCRELISA等，一直存在两大难题：即PCR的假阳性污染和定量准确度。一方面这些方法都要经过复杂的后处理过程，造成假阳性污染，另一方面所有这些方法的定量都是针对PCR终产物进行，而PCR的平台效应大大干扰了PCR的原始模板数量与终产物之间的相关性，使定量准确度难以提高。而FQPCR方法采用完全闭管检测，不需PCR后处理，避免了交叉污染。同时采用实时检测技术，所得CT值和原始模板数量完全呈线性相关，因而定量准确率极高。其操作也简便快速。

　　ELISA方法一直是临床诊断HBV感染的传统手段，它实际检测的是人体对HBV的免疫反应状态。而PCR方法则是检测HBV病毒自身，更准确灵敏的反应了HBV的感染和恢复情况。FQPCR是从扩增的DNA分子直接利用光能转换的原理作定量的数据读取分析,排除了标本污染的可能性［1］。FQPCR可以正确定量出0拷贝～1010拷贝的病原体数量范围，具有很重要的临床诊断价值。

　　抗HBs阳性表明机体曾感染过乙肝或注射乙肝疫苗后产生保护抗体，对再次感染有抵抗力。本研究中66例HBsAb(+)有4例，HBVDNA阳性7.24×104～8.77×105 CP/ml，占6.1%，出现这种情况可能是乙肝病毒突变或抗HBs滴度低，免疫力有限。有学者［2］认为此时应加强乙肝疫苗注射。HBsAb(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)表明曾感染过乙肝，现处于恢复期，无传染性。本文146例HBsAb(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)33例阳性，占22.6%，表明仍有少数患者HBV呈低水平复制，肝细胞内仍有HBV增殖，在机体抵抗力低时，有乙肝复发的可能。乙肝五项全阴性一般认为无乙肝病毒感染，此次研究发现286例中有4例HBVDNA阳性，占1.4%，其原因可能是：HBV在X区核苷酸(nt)位置17701767处8个碱基出现缺失，导致读框移位，产生一个新的终止密码，致使HBsAg和HBcAg前基因的合成下降，HBV处于低水平复制［3］，此时患者的体液免疫对HBV处于低应答状态，血清中HBsAg和HBcAg处于低水平，用常见的免疫学方法不能检出，即引起HBV血清标志物阴性而HBVDNA阳性。急性乙肝抗原抗体以复合物形式存在，HBV可以在肝细胞内长期隐藏，可以持续性低水平复制，故有人认为常规检测方法不能发现HBV低水平感染是乙肝疫苗自动免疫失败的重要原因。Liang等［4］报道36例HBV血清学标志物均阴性的慢肝患者PCR检测有11例(31%)HBVDNA阳性。由此表明在临床中对常规酶标法检测血清HBV五项全阴性的肝炎患者，不要轻易排除HBV感染；而抗HBs阳性也不能完全肯定乙肝不会复发，建议采用定量PCR进一步检查。380例HBsAg、HBeAg、HBcAb均阳性的标本中HBVDNA阳性率达100%；246例HBsAg、HBeAb、HBcAb阳性患者HBVDNA阳性率88.6%；210例HBsAg(+)、HBeAg(+) 的患者HBVDNA阳性率高达98.1%；190例HBsAg(+)、HBcAb(+)的患者HBVDNA阳性率也有69.5%。以上结果表明FQPCR可以清楚反应乙肝总病程变化及真实反应HBV感染和复制情况，进而用于临床诊断治疗和疗效观察。有学者［5］研究了FQPCR与拉米夫啶抗HBV疗效的关系，认为HBVDNA>1.0×105 CP/ml时需进行抗病毒治疗并可作为乙肝抗病毒治疗的选择标准。

　　本研究认为荧光定量PCR检测HBVDNA能直接反映血清HBVDNA含量,在判断体内HBV是否复制、复制程度、HBV是否被清除及HBV血清标志物阴性肝炎的诊断等方面明显优于HBV血清标志物检测。荧光定量PCR检测HBVDNA是抗病毒治疗选择和抗病毒疗效考核的最直接最可靠的指标，具有重要的临床价值，值得推广应用。

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　　［1］Gilliand G,Perrin S,Blianchard K，et al.Analysis of cytokine mRNA and:Detection and quantitation by competitive polymerase chain reaction.Proc［Ｊ］.Acad,Sci USA,1990,87:2725.

　　［2］张明辉,李炎萍,王江平，等.乙肝标志物不典型阳性的临床意义［J］.中西医结合脾胃杂志,1999,7(1):11.

　　［3］Saito T,Shinzwa H,Uchida,et al.Quantitative DNA analysis oflowlevel hepatitis B vire mia in two patients with serologically negative chronic hepatits B ［J］.J Med Virol,1999,58(4):325.

　　［4］Liang TJ,Baruch Y,BenPorath E，et al.Hepatitis B infection in patients with idiopathic liver disease［Ｊ］.Hepatology,1991,13(6):1044.

　　［5］朱水山,余戎.荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒的临床研究［J］.实用临床医学,2003,(4):33.