类风湿性关节炎患者Th1/Th2、Tc1/Tc2细胞的检测及意义

【关键词】  类风湿性关节炎；T细胞亚群；三色流式细胞术风湿性关节炎

　　［摘  要］ 目的：探讨类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)患者外周血Th1/Th2、Tc1/Tc2细胞亚群极化状态，分析RA的免疫学发病机制，为RA的临床提供理论依据。方法：收集RA患者及健康者外周抗凝静脉血，分离纯化淋巴细胞。FITC标记的抗CD3单抗，Cy5标记的抗CD4、CD8单抗，PE标记的抗CD30单抗，以CD3/CD4、CD3/CD8设门作三色流式细胞术(Triscolor flow cytometry)，分析RA患者T细胞亚群极化状态。结果：与正常对照相比，RA患者外周血CD4+细胞百分率显著升高(P＜0.01)，CD8+细胞百分率则无明显变化(P＞0.05)，CD4+/CD8+比例明显升高(P＜0.05)；CD3＋CD4＋CD30-细胞百分率、CD4＋CD30－/CD4＋CD30＋和CD8＋CD30－/CD8＋CD30＋比例均明显升高(P＜0.01)，而CD3＋CD4＋CD30＋、CD3＋CD8＋CD30－及CD3＋CD8＋CD30＋细胞百分率无明显变化(P＞0.05)。结论：RA患者外周血存在细胞免疫功能失调，T细胞亚群极化状态发生改变，呈明显的Th1类细胞优势；Th1/Tc1型细胞介导的细胞免疫可能与RA的发病机制有关。
　　
　　［关键词］ 类风湿性关节炎；T细胞亚群；三色流式细胞术

　　Detection of the Th1/Th2、Tc1/Tc2 Subsets in Rheumatoid Arthritis Patients and Its Significance

　　Abstract：Objective To investigate the polarization of T cells subset and analyze the immunologic pathogenesis in RA.Methods The ratios of CD4+/CD8+,CD3+CD4+CD30-/CD3+CD4+CD30+ and CD3+CD8+CD30-/CD3+CD8+CD30+ in peripheral blood T cells were analyzed by immunofluorescence staining and tris-color flow cytometry in vitro.Results Compared with the ratios of CD4+/CD8+(1.57±0.04) in healthy people,the ratios of CD4+/CD8+(1.95±0.05) in RA in creased obviously (P＜0.05).Compared with the ratios of CD3+CD4+CD30-/CD3+CD4+CD30+(15.74±5.36) and CD3+CD8+CD30-/CD3+CD8+CD30+(15.82±4.03) inhealthy people,theratiosofCD3+CD4+CD30-/CD3+CD4+CD30+(20.72±7.34)and CD3+CD8+CD30-/CD3+CD8+CD30+ (19.81±3.28).FCM analysis showed that average percentages of CD4+(47.42%±2.68%) in RA increased sharply (P＜0.01) versus 40.27%±2.53% in healthy people,while the average percentages of CD8+,CD3+CD4+CD30+,CD3+CD8+CD30- and CD3+CD8+CD30+ did not changed versus healthy people.Conclusion The ratios of CD4+/CD8+,CD3+CD4+CD30-/CD3+CD4+CD30+ and CD3+CD8+CD30-/CD3+CD8+CD30+ in peripheral blood T cells were increased obviously in RA.It suggested that cellular immunity in RA is shifted to Th1 type immunity.

　　Key words：Rheumatoid arthritis(RA)；T cell subsets；Trisclolr flow cytometry

　　类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是以慢性多关节滑膜炎症为主要特征的全身性自身免疫性疾病。以往研究认为，患者血清中的类风湿因子(rheumatoid factor，RF)及其所形成的免疫复合物在关节囊滑膜处的沉积，是RA发生的主要因素。随着分子生物学和分子免疫学的发展，人们发现RA患者外周血T细胞亚群的异常极化在RA发病过程中起着重要作用。然而，有关T细胞亚群极化状态的研究，结论并不一致［1］。本文拟采用三色流式细胞术分析RA患者外周血T细胞亚群的极化状态，并探讨其在RA发病过程中的作用。

　　1  材料与方法

　　1.1  研究对象 

　　RA患者34例，取自我院病人，男19例，女15例，年龄25岁~64岁，中位年龄49.2岁，所有病例符合1987年美国风湿病学会(ACR)修订的标准；正常对照35例，均为我院健康体检者，男17例，女18例，年龄20岁~62岁，中位年龄46.7岁。

　　1.2  试剂和仪器 

　　淋巴细胞分离液购自上海华精公司。FITC标记的抗CD3单抗，Cy5标记的抗CD4、CD8单抗，PE标记的抗CD30单抗，以及相应标记的小鼠抗人IgG1阴性对照为EB公司产品。FACSCalibur流式细胞仪购自BD公司。

　　1.3  研究方法

　　1.3.1  外周血单个核细胞(Peripheral blood monoeuclear cell，PBMC)的分离  采RA患者及正常对照外周静脉血各4 ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离得单个核细胞，然后加入0.85%NH4Cl溶液溶解红细胞。用20%的小牛血清RPMI1640培养液调整细胞浓度约2×106。SAP/P免疫组化法检测其纯度大于98%，台盼蓝拒染法检测其活性大于95%。

　　1.3.2  T细胞亚群的测定

　　取3支试管，各加入100 μl PBMC悬液，3管分别加入小鼠抗人IgG1FITC、小鼠抗人IgG1Cy5及小鼠抗人IgG1PE(阴性对照管)；抗CD3单抗FITC、抗CD4单抗Cy5、抗CD30单抗PE(CD4+管)；抗CD3单抗FITC、抗CD8单抗Cy5、抗CD30单抗PE(CD8+管)。各种标记抗体均15 μl。混匀，4 ℃避光30 min，PBS洗涤2次，各管加入0.5 ml缓冲液，上流式细胞仪检测。

　　1.4  统计处理
 
　　所有结果以±s表示，两两比较采用成组t检验，经SAS 8.22软件分析。以P＜0.05为差异有显著性，P＜0.01为差异有异常显著性。

　　2  结果

　　2.1  CD4+T、CD8+T细胞的检测 

　　RA患者外周血CD4+细胞百分率显著升高，与正常对照比较差异有异常显著性(P＜0.01)；CD8+细胞百分率无明显变化，与正常对照比较差别无统计学意义(P＞0.05)；CD4+/CD8+比例明显升高，与正常对照比较差异有显著性(P＜0.05)，见表1。表1  RA患者及正常对照外周血CD4+/CD8+细胞的检测(略) 注：与对照组比,(a) P＜0.01;(b) P＞0.05;(c) P＜0.05 

　　2.2  Th1/Th2、Tc1/Tc2细胞亚群的检测 

　　RA患者外周血CD3＋CD4＋CD30－细胞百分率，CD4＋CD30－/CD4＋CD30＋和CD8＋CD30－/CD8＋CD30＋比例均明显升高，与正常对照比较差异有异常显著性(P＜0.01)；CD3＋CD4＋CD30＋、CD3＋CD8＋CD30－、CD3＋CD8＋CD30＋细胞百分率无明显变化，与正常对照比较差别无统计学意义(P＞0.05)。见表2。表2  RA患者及正常对照外周血T细胞亚群百分率的检测(略)注：与对照组比，(a) P＜0.01;(b)P＞0.05

　　3  讨论

　　RA是一种目前病因尚不清楚的，以关节组织慢性炎症性病变为主要表现的全身性自身免疫性疾病。一般认为，RA的多发性关节炎是由RF引起的。然而近年来研究发现，T细胞亚群极化状态的异常在RA的发病过程中起重要作用［2］。因此，深入研究T细胞亚群极化状态对阐明RA的病理机制具有重要意义。然而这方面的结论并不一致，Th1型细胞优势或Th2型细胞优势均有报道。

　　目前研究资料表明，CD4+/CD8+细胞的平衡在自身免疫病的发生过程中起重要作用［3］。CD4是T辅助/诱导细胞(Th/Ti)的表面标志，CD4+T细胞具有辅助T细胞转变成效应细胞、B细胞转化成浆细胞以及活化巨噬细胞等功能，起辅助、诱导细胞及体液免疫的作用。CD8是T抑制/杀伤细胞(Ts/Tc)的表面标志，CD8+T细胞具有细胞毒效应及抑制T细胞活化、抑制B细胞产生抗体，起抑制细胞及体液免疫的作用。CD4+/CD8+比例变化反应了机体的免疫功能状况，比例升高表明免疫功能亢进，比例降低表明免疫功能低下。本研究发现，RA患者CD4+T百分率及CD4+/CD8+比例均明显升高，CD8+T百分率无明显变化。结果提示，RA患者Th/Ti数量及比例增高，反应了RA患者体内存在细胞免疫调节异常，过多的Th/Ti引发B细胞大量增生，诱导自身抗体的产生，导致RA的发生。

　　人类CD4+T细胞根据其分泌的细胞因子不同至少可分为Th0、Th1、Th2三个亚群。其中Th1亚群可分泌IL2，IFNγ等细胞因子，促进细胞免疫，激活细胞毒T细胞、巨噬细胞，吞噬杀伤靶细胞，也可分泌TNFα、β等细胞因子作用于靶细胞；Th2亚群主要分泌IL4、IL5、IL10等细胞因子而促进体液免疫反应。近年来研究发现，人类CD8+T细胞至少可分为Tc1、Tc2两个亚群。Tc1与Th1相似，可分泌IL2、IFNγ等细胞因子；Tc2与Th2相似，可分泌IL4，IL5，IL10等细胞因子［4］。Chen等［5］在研究T细胞亚群与系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)的关系时将Th1/Tc1、Th2/Tc2细胞分别称为Th1型、Th2型细胞。Th细胞间的平衡状态与多种疾病的发生发展密切相关，Dominguez等［6］认为 Th1/Th2细胞间的平衡，是体内体液免疫及细胞免疫间重要的调节枢纽。因此，建立一种准确、灵敏、快速的检测Th的方法十分必要。目前检测Th1/Th2的方法有多种，其基本原理都是外周血淋巴细胞经刺激后，检测培养液中细胞因子的含量或者检测细胞内细胞因子的表达。但是它们都无法判断所分泌的细胞因子是来自CD4+Ｔ细胞或是其他单个核细胞，所以并不能真正地检测出Th细胞的极化状态。

　　CD30属肿瘤坏死因子(TNF)/神经生长因子(NGF)受体超家族成员。近年来研究发现，CD30不仅仅是一种细胞表面标志，CD30的表达与T细胞的功能、T细胞的活化等关系十分密切；CD30在T细胞亚群的表达存在差异，激活的CD4+Th2细胞可持续高表达CD30，而CD4+Th1细胞仅微量表达或完全不表达CD30［7］。另外，CD30在CD8+T细胞也有相似的表达，产生Th1型细胞因子的Tc1细胞完全不表达CD30，而产生Th2型细胞因子的Tc2细胞高表达CD30［8］。本研究采用三色流式细胞术，分别以CD3/CD4、CD3/CD8设门检测Th细胞和Tc细胞，在此基础上结合CD30分子检测Th细胞和Tc细胞的极化状态，即CD3＋CD4＋CD30－为Th1细胞、CD3＋CD4＋CD30＋为Th2细胞、CD3＋CD8＋CD30－为Tc1细胞、CD3＋CD8＋CD30＋为Tc2细胞。因此，我们的结果可以真实、准确地反映Ｔ细胞亚群的极化状态。

　　T细胞亚群的异常极化状态在RA的发生发展中具有重要作用。朱剑等［9］研究了来氟米特对RA患者外周血Th1/Tc1细胞的影响，他们发现RA患者外周血淋巴细胞以Th1/Tc1型细胞为主，而且来氟米特后，患者外周血Th1/Tc1细胞明显减少。我们的结果显示，与正常对照比较，RA患者外周血Th1细胞百分率、Th1/Th2及Tc1/Tc2比例均明显升高，这一结果与上述作者的报道相似。RA患者外周血Th1/Tc1细胞极化优势将导致Th1型细胞因子，如IL2、IIFNγ、TNFα等炎症因子产生增多，这些炎症因子在形成和促进RA炎症中起着重要的作用。应用胶原性关节炎动物模型表明，抗炎因子＋IL4和IL10联合治疗后，能使动物体内的Th0细胞向Th2细胞转化，并能使病情显著好转［10］。Matsuno等［11］发现给予TNFα后动物模型滑膜液炎症细胞明显增多，而给予抗TNFα单克隆抗体后动物模型滑膜液炎症细胞明显降低。以上结论均证实RA为Th1/Tc1型细胞优势的自身免疫病。

　　我们的实验表明，通过研究自身免疫病中Th1型/Th2型细胞极化状态，不仅有助于阐明自身免疫病的发病机制，而且有可能为我们提供治疗自身免疫病的新方法，即通过调节Th1型/Th2型细胞的极化状态的平衡，来调节过强的体液免疫或细胞免疫，达到治疗自身免疫病的目的。

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　　［1］Zhang H,Dong SK,Li XL,et al.Role of T helper cell subsets in the pathogenesis of rheumatoid arthritis ［J］.Chin Clin Reh J.2003,7(24):33143315.

　　［2］Yudoh K,Matsuno H,Nakazawa F,et al.Reduced expression of the regulatory CD4+ T cell subset is related to Th1/Th2 balance and disease severity in rheumatoid arthritis［Ｊ］.Arthritis Rheum.2000,43(3):617627.

　　［3］Haggqvist B,Hultman P.Effects of deviating the Th2response in murine mercuryinduced autoimmunity towards a Th1response ［J］.Clin Exp Immunol.2003,134(2):202209.

　　［4］Woodland DL,Dutton RW.Heterogeneity of CD4 (+) and CD8 (+) Tcells［J］.Curr Opin Immunol，2003,15(3):336342.

　　［5］Chen S,Hu D,Shi X,et al.The relationship between Th1 /Th2 type cells and disease activity in patient with systemic lupus erythematosus［J］.Chin Med J (Engl)，2000,113(10):877880.

　　［6］DominguezGarcia MV,RodriguezMoyado H.Cellular and biochemical mechanisms involved in physiopathgenesis of autoimmune thrombocytopenic purpura ［J］.Gac Med Mex.2002,38(5):461472.

　　［7］Del Prete G,De Carli M,D'Elios MM,et al.CD30mediated signaling promotes the development of human T helper type 2like T cells［J］.J Exp Med，1995,182(6):16551661.

　　［8］VukmanovicStejic M,Vyas B,GorakStolinska P,et al.Human Tc1 and Tc2/Tc0 CD8 Tcell clones display distinct cell surface and functional phenotypes［J］.Blood，2000,95(1):231240.

　　［9］朱剑,黄烽,张江林,等.来氟米特对类风湿关节炎患者外周血Th1/Tc1细胞的影响［J］.中华风湿病学杂志,2003,7(9):554556.

　　［10］Mauri C,Williams RO,Walmsley M,et al.Relationship between Th1/Th2 cytokine patterns and the arthritogenic response in collageninduced arthritis［Ｊ］.Eur J Immunol，1996,26(7):15111518.

　　［11］Matsuno H,Yudoh K,Katayama R,et al.The role of TNFalpha in the pathogenesis of inflammation and joint destruction in rheumatoid arthritis (RA):a study using a human RA/SCID mouse chimera