解脲脲原体的DNA模板制备方法的研究比较
作者：盛敏玲，濮跃晨，朱长太，姚余有，赵政龙，卫广英，赵卫东，高婷
【关键词】 解脲脲原体；检测；模板制备；PCR
［摘 要］ 目的：从蛋白酶K法，酚-氯仿法，双蒸水煮沸裂解法中遴选出提取UuDNA的较好方法。方法：分别以双蒸水煮沸裂解法，蛋白酶K法(PK法)及酚-氯仿提取法提取UuDNA模板并作比较。结果：PK法及酚-氯仿提取法比较两法无差异，双蒸水煮沸裂解法与酚-氯仿提取法比较前者敏感率较低。结论：应用PCR检测Uu，PK法及酚-氯仿法均可用于UuDNA模板的提取，而双蒸水煮沸裂解法不主张应用。
［关键词］ 解脲脲原体；检测；模板制备；PCR
解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum, Uu)属脲原体(Ureaplasma)，无细胞壁及前体，细胞器极少，由于Uu通过性接触、分娩时经产道等途径传播，故而Uu感染引起的疾病也被列为STD疾病范畴。
研究Uu与疾病的关系最早是从非淋病性尿道炎开始的。近年来，大量研究证实：Uu与非淋病性尿道炎、前列腺炎、睾丸炎、尿结石、膀胱结石、妇科疾病、新生儿低体重、新生儿肺炎等多种疾病有关。由此，Uu对人体健康的危害不容忽视，有必要对其进行检测和。
目前，Uu检测的方法主要有培养法、PCR法等。对于PCR方法检测Uu，关键环节之一是UuDNA的提取。而对于UuDNA的提取成功与否，DNA提取方法的选择至关重要。由于Uu属原核微生物，其细胞特性与细菌相似，故结合报道［1～3］选取三种方法(经典的酚-氯仿提取法、PK法及双蒸水煮沸裂解法)作为候选方法提取UuDNA，扩增后对其结果进行比较，以遴选出提取UuDNA的较好方法。
1 资料与方法
1.1 标本来源与采集
全部检测对象来自于性病科、妇产科、泌尿外科。标本采集：男性，以一次性无菌拭子深入尿道2 cm～3 cm处取尿道分泌物(轻轻转动并停留10 s后取出)；女性，以一次性无菌拭子在宫颈口处取上皮细胞。其中，男性29例；女性33例，合计62例。
1.2 UuDNA模板的制备
1.2.1 双蒸水煮沸裂解法
标本加入500 μl双蒸水14 000 r/min离心20 min，弃上清。加入500 μl双蒸水，100 ℃煮沸20 min，离心(15 000 r/min,10 min )。取上清液加入500 μl 0.6体积冷异丙醇,0.1体积3 mol乙酸钠(pH 4.8), 4 ℃离心去上清液。沉淀用70%乙醇洗涤,真空干燥。加入TE液100 μl溶解。-20℃或4℃保存。
1.2.2 PK法
标本加入500 μl双蒸水14 000 r/min离心20 min; 弃上清，加300 μl裂解液及2.0 mg/ml蛋白酶K 100 μl，55 ℃孵育1 h后,98 ℃作用20 min。加入400 μl 0.6体积冷异丙醇,0.1体积3 mol pH 4.8乙酸钠,4 ℃离心去上清液。沉淀用70%乙醇洗涤,真空干燥。加入TE液100 μl溶解。-20℃或4℃保存。
1.2.3 酚-氯仿提取法
标本加入500 μl双蒸水14 000 r/min离心20 min; 弃上清。加入500 μl裂解液(含1/10体积酚),(65 ℃预热),95 ℃10 min。加入等体积苯酚-氯仿-异丙醇,65℃放置30 min，间隔5 min～10 min轻摇一次, 离心(15 000 r/min,5 min)。取上层水相加入等体积的氯仿-异丙醇液65 ℃放置30 min，间隔5 min～10 min轻摇一次, 离心(15 000 r/min,5 min )。取上层水相加入0.6体积冷异丙醇,0.1体积3 M pH 5.2乙酸钠,放置30 min，4 ℃，离心15 000 rpm,5 min去上清液。沉淀用70%冷乙醇洗涤,真空干燥。加入TE液100 μl溶解。-20 ℃或4 ℃保存。
1.3.2 PCR检测
三种方法制作的模板分别以PCR扩增。扩增结束后每EP管加入6×载样缓冲液10 μl，混匀。取10 μl混合DNA样品加入2%含溴化乙锭琼脂糖凝胶电泳(5 V/cm)30 min～40 min。紫外灯下观察结果并以凝胶成像系统保存图像。
2 结果
2.1 酚-氯仿法法与双蒸水煮沸裂解法的比较
两者相比较χ2=4.900 ，P=0.026 3 。P<0.05。差异有统计学意义。结果表明：酚-氯仿法提取DNA模板Uu阳性检出率高于应用双蒸水煮沸裂解法提取DNA模板的Uu阳性检出率,见表1。表1 酚-氯仿法与双蒸水煮沸裂解法扩增Uu的结果酚-氯仿法 双蒸水煮沸裂解法 （略）
2.2 酚-氯仿法法与PK法的比较
两法比较χ2=0.167，P=0.714，P>0.05，差异无统计学意义。结果表明：酚-氯仿法法提取DNA模板与PK法提取DNA模板比较，Uu的检出率无差异(见表2)。表2 酚-氯仿法法与PK法扩增Uu的结果酚-氯仿法双蒸水煮沸裂解法（略）
3 讨论
目前，Uu的检测方法主要有培养法、PCR法等［4～6］。对于应用PCR法检测Uu，其DNA模板制作是一个非常关键的环节。提取Uu的DNA模板的质量(纯度和含量)好坏直接影响Uu的检测结果。从理论上来说，对于Uu的DNA提取关键问题需要解决的问题有：DNA主要存在于细胞核中，必须除去核外的核膜和质膜；除DNA外，还有RNA，且以DNA以的形式存在。将细胞核中的DNA和RNA分开，核蛋白体中的DNA和蛋白质分开；去除蛋白质等杂质使DNA更加纯化。
本文中应用的酚-氯彷法及PK法提取DNA的机制和思路是：SDS溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其他细胞组份，用异丙醇乙酸钠沉淀核酸。加入的适量的乙二胺四乙酸EDTA能防止DNA酶解。在浓氯化钠溶液中，DNA核蛋白的溶解度很大，而RNA核蛋白的溶解度很小，故利用DNA和RNA在浓氯化钠溶液中溶解度的不同析出DNA。DNA不溶于异丙醇，利用异丙醇沉淀法可以使其进一步纯化。蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白。在酚氯彷法及PK法实验中要注意：裂解液要预热以抑制DNase, 防止DNA酶解，加速蛋白变性, 促进DNA溶解。取各上清时,要防止非核酸类成分混入。酚一定要碱平衡。异丙醇、乙醇、NaAC等要预冷,以减少DNA的降解, 促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。
双蒸水煮沸裂解法提取DNA的机制是在低渗环境下造成细胞裂解，通过高温煮沸使细胞的蛋白质变性，暴露出DNA从而提取。
本文研究的结果显示，PK法及经典的酚-氯仿提取法比较两法无差异，而双蒸水煮沸裂解法与酚-氯仿提取法比较，双蒸水煮沸裂解法检出率较低。作者认为，双蒸水煮沸裂解法其缺陷可能在于：其不能充分裂解Uu暴露DNA，高温煮沸造成蛋白质变性，而变性蛋白不易纯化而残存抑制了Taq酶的活性，影响扩增效率甚至导致假阴性结果。因此根据原核微生物DNA提取理论基础结合本文研究结果认为，Uu DNA的提取可以选择PK法及酚-氯仿提取法，不应选择双蒸水裂解法。
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［1］K Povlsen,J S Jensen, I. Lind .Detection of Ureaplasma urealyticum by PCR and Biovar Determination by Liquid Hybridization J. Clin［Ｊ］. Microbiol. 1998， 36: 32113216.
［2］S. Nelson, A. Matlow, G. Johnsonet al Detection of Ureaplasma urealyticum in Endotracheal Tube Aspirates from Neonates by PCR J Clin［Ｊ］. Microbiol, 1998， 36: 12361239.
［3］M AbeleHorn, C Wolff, P Dressel et al.Association of Ureaplasma urealyticum biovars with clinical outcome for neonates, obstetric patients, and gynecological patients with pelvic inflammatory disease J. Clin［Ｊ］. Microbiol,1997，35:11991202.
［4］Deodhar LP, Gogate AS.Modified TALC colour change medium for the identification of Ureaplasma urealyticum［Ｊ］. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2003;23(2):203205.
［5］Detection using molecular biology techniques of Mycoplasma hominis and Ureaplasma urealyticum in urogenital samples［Ｊ］． Rev Argent Microbiol,1998;30(2):5358.
［6］Kiseleva VI,Shcherbo SN,Zaitseva SP.Detection of Chlamydia trachomatis.and Ureaplasma urealyticum by hybridization analysis using DNA-Pt ((dien) Cl) Cl-probes and PCR［Ｊ］.Biokhimiia,1995，60(5):783790.
