均匀设计法优选盐酸小檗碱脂质体的处方
作者：谭丽蓉，李国强，陈俊威，苏炜，容凯文
【摘要】 目的：对盐酸小檗碱脂质体的处方进行优化。方法：采用薄膜蒸发—主动载药法制备盐酸小檗碱脂质体，按均匀设计法，以包封率和载药量为考察指标，对实验结果进行最优子集法的二次回归优选处方配比。结果：采用优化处方制备的脂质体，平均包封率为79.33％，载药量30.21，粒径范围为2.2 μm~3.8 μm。结论：用均匀设计法优化后的处方制得的盐酸小檗碱脂质体，包封率和载药量都较高。
【关键词】 盐酸小檗碱；脂质体；均匀设计法；处方优化
Application of Uniform Design for Preparation of Berberine Hydrochloride Liposomes
Abstract：Objective To optimize the formulation in the preparation of berberine hydrochloride liposomes.Methods Using thin film evaporation and active loading method to prepared berberine hydrochloride Liposomes according to the uniform design, a optimum formulation was established by detemining the encapsulation efficiency and ratio of loading drug.Results The average encapsulation efficiency and ratio of loading drug of the optimized liposomes were 79.33％and 30.21 , their size range was 2.2 μm~3.8 μm.Conclusion The application of the uniform design is useful to achieve a large encapsulation efficiency and ratio of loading drug.
Key words:Berberine hydrochloride;Liposomes;Uniform design;Optimum preparation
盐酸小檗碱（黄连素）是从毛茛科植物根茎中提取的一种异喹啉生物碱，临床主要用于清热解毒、肠道感染，近年发现还有治疗心律失常、高血压、高脂血症、糖尿病和抗肿瘤等作用。研究发现，盐酸小檗碱对人类肝癌细胞、艾氏腹水瘤、结肠癌细胞、食道癌细胞系、鼻咽癌细胞、膀胱癌细胞、恶性畸胎瘤细胞、大鼠9 L脑肿瘤细胞等都具有一定的抑制和杀灭作用［1］。黄林清［2］等在进行抗肿瘤的实验中发现，盐酸小檗碱体内抑瘤作用没有体外作用明显，可能与其肠道吸收差，在体内很难达到对肿瘤细胞有效的血药浓度有关。脂质体是一种新的给药系统，能增加药物局部浓度，提高药物疗效，减少药物的不良反应。本文通过均匀设计法对盐酸小檗碱脂质体的制备处方进行了优化。
1 仪器和试药
1.1 仪器 RE-52A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）； UV-2401型紫外分光光度计（日本岛津）； JEM-2000 Ex型透射显微镜（日本）；DZF-6050型真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；GB 204梅特勒电子天平（瑞士）。
1.2 试药 盐酸小檗碱（简称Bb,四川什邡华安药物原料有限公司）；卵磷脂（SPC，华东师范大学化工厂）；胆固醇（CH，医药上海化学试剂公司，分析纯）；维生素E（VE，浙江医药股份有限公司新昌制药厂）；阳离子交换树脂（上海树脂厂）；其它试剂为分析纯。
2 方法
2.1 Bb脂质体的制备工艺［3］ 采用薄膜蒸发－主动载药法制备盐酸小檗碱脂质体，按一定比例定量称取SPC、CH、VE溶于适量无水乙醇，于60 ℃水浴中加热溶解，减压蒸发；制备卵磷脂膜后，加入枸橼酸缓冲液（pH＝3.64），水化，得空白脂质体；将所得空白脂质体用0.8 μm的微孔滤膜过滤后，加入Bb溶液，并加入NaHCO3溶液（pH＝8.32）调外水相值，水浴孵化，得到Bb脂质体混悬液（1 mg/ml）。
2.2 包封率及载药量的测定
2.2.1 Bb标准曲线的制作 用pH 7.0磷酸缓冲液（PBS）配制一定浓度的Bb溶液及脂质体成膜材料溶液，经紫外分光光度计扫描得知Bb在344 nm处有最大吸收，而脂质体成膜材料如SPC、CH、VE等在该波长处几乎无吸收，故选择344 nm为Bb含量的测定波长。精密称取Bb标准品20 mg，置100 ml量瓶中，加入PBS使完全溶解，并稀释至刻度，摇匀。再将该溶液用PBS稀释成含Bb 0.25 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、4.0 mg/L、8.0 mg/L、16.0 mg/L的溶液，以PBS作参比，于344 nm处测定吸收光度。结果表明，在0.25 mg/L～16.0 mg/L的浓度范围内，Bb的吸收度A与其浓度C呈线性关系，线性回归方程为A=6.412×10?2C＋2.540×10?3，r＝0.999 2。
2.2.2 包封率的测定［3］ 取脂质体混悬液0.1 ml 2份，一份直接加入95％乙醇6 ml溶解，用PBS稀释至刻度，摇匀；另一份加于阳离子交换树脂顶端吸附，然后用PBS洗脱，收集滴出液于10 ml的量瓶中，加入95％乙醇6 ml溶解脂质体，用PBS稀释至刻度，摇匀；分别于344 nm处测定吸收光度值A。包封率E% =(A1/A2)×100％(其中A1、A2 分别为过阳离子柱和未过阳离子柱样品的A值) 。
2.2.3 载药量的测定［4］ 载药量LP＝（M1－M2）/M3×100
(其中M1为脂质体中盐酸小檗碱的总含量；M2为游离药物含量，通过C2 －C1求出； M3为卵磷脂的用量)。
2.3 脂质体的形态和粒径分布 将样品涂在有支持膜的铜网上，用磷钨酸进行负染，凉干，用透射电镜观察脂质体的形态和粒径分布。
2.4 均匀设计法优选处方 根据预实验结果确定3个考察因素：制备Bb脂质体SPC、CH和Bb的用量。用均匀设计3.0版软件筛选出U 8（83）配方均匀设计表安排8次实验，见表1。
表1 U8（83）均匀设计拟水平表（略）
3 结果
3.1 均匀试验结果 以包封率E、载药量LP为考察指标，对均匀试验数据进行分析处理。考虑到包封率和载药量在脂质体的制备方法评价中占有同样重要的地位，分别将两者测量值最大的一组定为1，其余按比例缩放，得到相对得分Y1、Y2，以体现二者平衡的权重。最后以综合得分Y=Y1+Y2为标准对结果进行评价，见表2。
3.2 结果 利用均匀设计程序，通过计算机进行最优子集的二次配方回归得：Y＝31.13-51.62 A-71.80 B+22.82 A2+60.20 AB+43.61 B2残差标准差s＝0.0668，相关系数R＝0.991 0，F检验值：F＝20.32，该方程的可信度显著。
3.3 最佳条件的判定 由计算回归得出Ymax＝1.829 0，选择对应的条件A＝0.182 0，B＝0.600 0，C＝0.225 8为优化条件，此条件在各因素实验水平范围内，且得到的Y值高于各次实验结果。
3.4 优化处方的验证实验 按照优化处方的配比制备3批脂质体，测得包封率分别为78.68％、79.06％、80.25％，平均79.33％；载药量分别为30.25、29.86、30.52，平均30.21。 验证实验结果证明通过均匀设计得出的最佳条件可以在获得较高包封率的基础上，得到较高的载药量。在透射电镜下，可看到脂质体颗粒多呈球形或类球形，粒径大小分布大约在2.2 μm～3.8 μm范围内。
表2 U8（83）均匀设计结果（略）
4 讨论
盐酸小檗碱极性较大，在胃肠道吸收极少。制成脂质体后，可增加其脂溶性，增加吸收，提高血药浓度，更好地发挥其在心律失常、高血压、高脂血症、糖尿病和抗肿瘤等方面的作用，并有望通过脂质体的修饰达到缓释和靶向给药的目的。本文采用均匀设计法优化盐酸小檗碱脂质体的制备处方，评价结果的依据为脂质体的包封率和载药量。单纯使用包封率作为评价指标存在不足，因为得到的结果是包封率随着卵磷脂浓度的增加呈线性增加，没有最优配比存在。同时使用包封率及载药量作为评价指标其实际意义也是明显的，无限稀释的盐酸小檗碱溶液无法体现脂质体载体增加盐酸小檗碱溶解性的优点，即使包封率再高也没有实际应用价值。本文采用了1：1平均二者权重的方法，突出了脂质体药物的载药量这个指标的重要性，体现了脂质体作为盐酸小檗碱载体的优势。利用均匀设计程序，通过计算机进行最优最优子集的二次配方回归方程，并由此得到的最佳制备配方为：胆固醇＝18.20，卵磷脂＝60.00，盐酸小檗碱＝22.58。本实验在该条件下可得到79.33％的包封率和30.21的载药量，虽然包封率不是最高，但载药量得到了充分重视，体现了盐酸小檗碱脂质体增加溶解度的特点，达到包封率和载药量的最优组合。有关该脂质体的稳定性、体内血药浓度、肿瘤组织的药物浓度和临床疗效等，将作进一步研究。
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［1］ 罗彪.黄连素抗肿瘤及放疗增敏作用的研究进展［J］.右江民族医学院学报，2004，26（2）：278.
［2］ 黄林清，徐传福.小檗碱抗肿瘤作用实验研究［J］.药报，1997，13（2）：189.
［3］ 邓意辉，王绍宁，吴琼，等.主动载药法制备盐酸小檗碱脂质体［J］.中国药学杂志，2004，39（1）：40?42.
［4］ 吕文莉，郭健新，平其能.灯盏花素脂质体的制备及其理化性质的测定［J］.中国天然药物，2004，2（5）：289?293.
