rsistin基因的克隆及载体的构建

【摘要】  目的：克隆小鼠resistin基因及其连载体的构建，为进一步研究resistin的功能打下基础。方法：根据报道的小鼠resistin基因的全长mRNA序列为目的基因，即提取小鼠脂肪组织中的RNA，以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，逆转录（RT）合成resistinDNA，再在TaqDNA聚合酶的作用下聚合酶链反应（PCR）扩增resistin cDNA，将扩增PCR产物（resistin cDNA）经纯化后与A?T连接于pGEM?T载体，重组质粒转化JM 109感受态菌，蓝白斑筛选阳性菌落，摇菌、提取质粒。结果：提取的总RNA纯度A260/280为1.9,电泳条带28 s∶18 s比例约为2∶1,RT?PCR与欲扩增的目的片段的理论长度363 bp相符,重组质粒插入pGEM?T的DNA片段的核苷酸序列与小鼠resistin基因mRNA编码区序列完全一致。结论：成功克隆了小鼠resistin cDNA基因，为构建resistin基因打下基础。

【关键词】  小鼠resistin基因；载体；构建

　　resisin又称抵抗素，可损害糖代谢，影响组织对胰岛素的敏感性［1］，被认为可能是联系肥胖与Ⅱ型糖尿病的重要纽带［2,3］。小鼠resistin基因mRNA全长519个碱基,编码区(cds)是由84位至428位共345个碱基组成,编码114个氨基酸残基组成的resistin蛋白质。目前对resistin的生物功能了解甚少，为了探讨resistin的功能，本研究拟用RT?PGR技术从小鼠脂肪组织中扩增resistin cDNA，A/T克隆于pGEM?T载体。为进一步研究resistin功能及与糖尿病的关系奠定实验基础。

　　1  材料与方法

　　1.1  主要试剂  TRIol Reagent总RNA提取和THERMOSCRIPTTM RT?PCR System（购自GIBCOL BRL公司），PCG引物（由TakaRa Biotech公司合成）Qiaquick Gel Extraction Kit、Plasmid Qiaprep Spin Miinprep Kit和Endofree Plasmid Maxi Kit（购自QIAGEN公司），pGEM?T vector systemI（购自promega公司），限制性内切酶XbaI、EcoRI和NotI(购自ENB或MBI Fermenta或Rroche公司),T4DNA连接酶(购自Takara  Biotech公司)，JM 109大肠杆菌由本院医学研究中心提供。

　　1.2  方法

　　1.2.1  总RNA测定  提取总RNA：取正常雄性BALB/C小鼠，16周龄，体重38 g（购自中山大学动物实验中心）。取其脂肪200 mg，按照一步法提取总RNA。检测总RNA：电泳检测总RNA质量；紫外分光光度法检测总RNA纯度和含量。RNA浓度：RNA=A260×40×稀释倍数。

　　1.2.2  逆转录合成cDNA  按Mmnlv RT?PCR试剂盒说明书操作逆转录合成cDNA。

　　1.2.3  PCR扩增resistin cDNA  PCR引物设计,根据小鼠resistin基因mRNA序列,用计算机软件设计引物,并在上、下游引物的5’端分别引入Eco R1和XbaⅠ酶切位点。上游引物：5'?CGGAATTCATGAACCTTTCATTTCC?3'（下划线的部分为Eco R1酶切位点）；下游引物：5'?CTAGTCTAGATCAGGAAGCGACCTGCAGCT?3'（下划线的部分为XbaⅠ酶切位点）；扩增resistin基因全长编码区序列,扩增片段理论长度为363 bp。在一个50 μl的反应体系中进行PCR，并对反应体系中RT产物、引物和MgCl2的量及热循环参数进行了数次优化，共同进行了35循环。2%的琼脂糖凝胶电泳成像。

　　1.2.4  凝胶回收纯化PCR产物  按Qiaquick Gel Extraction Kit操作说明，凝胶电泳观察回收结果,紫外分光光度法检测DNA含量及纯度检测。

　　1.2.5  受体感受态JM109菌的制备  用CaCl2法(0.1 M的进口CaCl2)制备感受态细胞。

　　1.2.6  纯化PCR产物A?T连接于pGEM?T载体  按插入片段与载体的摩尔比为3∶1的量进行连接反应,总反应体系10 μl,置4 ℃冰箱过夜连接。

　　1.2.7  连接反应液转化JM 109感受态菌液  连接DNA反应液10 μl,加入200 μl受体感受态菌液中，最后行蓝白斑筛选，挑选单个白色菌落，加入2 μl LB液体培养基中（含氨苄青霉素），37 ℃震荡增殖转化菌。

　　1.2.8  提取重组质粒PGEM?T?reisitin  上述菌液扩增至生长晚期，按Qiaprep Spin Miniprep Kit操作说明提取质粒。凝胶电泳提取的重组质粒的质量和紫外分光光度法检测DNA含量及纯度检测。

　　1.2.9  鉴定和保存重组质粒pGEM?T?reisitin  重组质粒pGEM?T?reisitin：双酶切鉴定(内切酶购自NEB公司)，反应体系如下:pGEM?T?reisitin(0.35 μg/μl)5 μl、EcoRI1 μl、XbaⅠ1 μl、10×NEBuffer 2 μl、10×BSA 0.2 μl加三蒸水至20 μl，37 ℃水浴2 hr紫外灯下观察结果；核苷酸序列分析鉴定：重组T载体送TakaRa Biotech公司测序。

　　2  结果

　　2.1  判断总RNA的质量和浓度  提取的小鼠脂肪组织总RNA，经凝胶电泳后，紫外灯下呈现清淅的28 s、18 s、HE 5 s三条带，且28 s与18 s条带丰度比约为2∶1，说明总RNA无降解。A260/280为1.9,表明总RNA纯度高，总RNA浓度为0.5 μg/μl,总量15 μg。

　　2.2  RT?PCR产物电泳分析  RT?PCR产物凝胶电泳后，紫外灯下可见一清晰的条带位于250 bp与500 bp，与欲扩增的目的片段的理论长度363 bp相符。

　　2.3  重组质粒pGEM?T?reisitin酶切鉴定  重组质粒被EcoRⅠ和XbaⅠ内切酶切为两条带，片段的大小与理论值pGEM?T3000 bp和插入的目的片段363 bp相符。

　　2.4  重组质粒pGEM?T?reisitin核苷酸序列分析  pGEM?T?reisitin核苷酸序列分析酶切位点图表明PCR产物已连于pGEM?T载体，插入pGEM?T的DNA片段的核苷酸序列顺向测序和反向测序均证明插入的DNA片段与小鼠reisitin基因mRNA编码区序列完全一致。

　　3  讨论
　　
　　据报道reisitin基因仅在白色脂肪（WAT）中大量表达，且小鼠成年后较出生时reisitin mRNA表达增高。小鼠6周～9周性发育成熟，即进入成年期。本研究挑选16周的成年雄性小鼠，取其附睾周围及网膜的WAT用于提取总RNA，以使被取的脂肪组织reisitin表达丰度高，有利于通过RT?PFR扩增reisitin cDNA。RT?PCR产物凝胶电泳鉴定，扩增出一特异性条带，大小在250 bp与500 bp之间，与目的片段的理论长度363 bp相符。推测它是欲扩增的reisitin cDNA。由于PCR产物直接进行双酶切，难以判断酶切成功与否，盲目接着进行下一步连接反应，易造成时间和试剂的浪费。因此，本研究选用T载体作为过渡。因Taq聚合酶具有在PCE产物3端加A碱基的功能，T载体是人工改良的两头3末端加有T碱基开环的质粒，PCR产物与T载体经T4DNA连接酶A?T连接，可大大提高带有Lacz基因，可行蓝白斑筛选转化阳性菌落。GEM?T质粒是专门用于“A/T克隆”高考贝数的T载体，达到3 000 bp，其带有1个氨苄青霉素抗性基因用于筛选，有多克隆酶切位点，使插入的DNA片段可通过内切酶再取出。多克隆酶切位点两侧分别带有T7和SP两个反向的噬菌体的启动子，这种构架允许外源DNA的任一条链在体外得到转录。本研究重组质粒pGEM?T?reisitin进行双酶切后，凝胶电泳，紫外灯下可见重组质粒被切为3 000 bp和363 bp的两条带，表明RT?PCR产物已连于pGEM?T载体。重组pCEM?T质粒的核苷酸序列分析显示，插入pGEM?T的DNA片段的核苷酸序列与报道的小鼠resistin基因编码区序完全一致，表明resistin基因cDNA克隆成功。这为构建resistin基因提供了物质基础。

【】
  　　［1］ Strppan CM，Brown EJ，Wright CM，et al.A family of tissues–pecific Resistin?like molecules［J］.P Natl Acad USA,2001,98（2）：502?506.

　　［2］ Senior K.Resistin links obesity to typeⅡdiabetes［J］.Lancet,2001,357:202.

　　［3］ Steppan CM，bailey ST，Bhat S，et al.he homone resistin linds obesity to diabetes［J］.Nature，2001,409:307?312.