Ret和GDNF蛋白在先天性巨结肠中的表达

【摘要】  目的：探讨Ret和GDNF蛋白二者表达与先天性巨结肠(HD)的关系。方法：对我院2002年至2006年手术切除的经病理诊断为HD的标本52例进行免疫组化Ret和GDNF染色，显微镜下观察。结果：52例HD扩张段Ret和GDNF蛋白均阳性表达，狭窄段均为阴性表达。结论：HD的发生与Ret和GDNF蛋白缺失有关，活检中检测两种蛋白可以提高HD的诊断准确率，减少误诊发生。

【关键词】  先天性巨结肠；免疫组化；Ret；GDNF

　　先天性巨结肠(Hirschsprung’s，sdiseasel HD)是小儿外科常见的消化道畸形，主要病改变是在狭窄的肠管黏膜下和肠肌层神经丛的神经节细胞完全消失，通常伴有黏膜肌层肥大以及黏膜下和固有肌层肌间神经数目和体积增加。其病因目前尚无定论，国外的研究表明HD与Ret原癌基因的灭活突变有关［1］，GDNF是胶质细胞来源牲神经营养因子，是转化生长因子β超家族成员中的一员，是Ret受体配体，能与Ret结合发挥作用。为探讨Ret和GDNF蛋白二者表达与先天性巨结肠之间的关系，我们采用免疫组化技术对HD狭窄段、移行段、扩张段组织进行Ret和GDNF蛋白的检测，旨在了解HD中Ret和GDNF表达的意义，为临床诊断提供一个可靠的免疫学指标。

　　1  材料与方法

　　1．1  标本来源  选自我院2002年1月至2006年12月手术切除的经病理诊断为HD的标本52例，其中普通型39例，长段型7例，短段型6例；男35例，女17例；年龄8 d～2岁，平均年龄6个月；新生儿15例。另选择无消化道畸形的尸体解剖标本6例的相应结肠为对照组。

　　1．2  试剂来源  Ret和GDNF均为多克隆抗体，购于北京中杉公司， SP试剂盒购于福州迈新生物技术公司。

　　1.3  免疫组织化学  免疫组织化学染色方法采用S?P法，染色操作步骤按说明书进行，切片均作高温、高压抗原修复。以PBS取替—抗作阴牲对照，分别用已知正常肠组织Ret和GDNF阳性组织切片作阳性对照。

　　1．4  结果判断  神经节细跑或神经纤维细胞中出现棕黄色颗粒为阳性细跑，观察指标以“+++、++、+、±、-”表达染色深浅。±以下为阴性染色，+为弱阳性染色，++以上为强阳性染色。

　　1．5  统计学方法  采用χ2检验。

　　2  结果

　　2．1  Ret蛋白的表达  Ret在对照组结肠与HD扩张段肠管肌间、黏膜下神经丛神经节细胞胞质呈强阳性染色，移行段神经节细胞体积较小，多呈团状分布，神经丛不典型，染色强度弱于正常段，狭窄段无Ret阳性细胞，见表1。

　　表1  Ret蛋白在HD的表达结果（略）

　　2．2  GDNF蛋白的表达  GDNF在对照组结肠和HD扩张段肠管肌间、黏膜下神经丛神经节细胞胞质呈强阳性染色，移行段神经节细跑、神经丛不典型，染色强度弱于正常段，狭窄段无GDNF阳性细跑，见表2。

　　表2  GDNF蛋白在HD的表达结果（略）

　　3  讨论

　　自从发现HD以来，人们对它的认识逐渐加深，目前大多数人认为，HD是多基因遗传性疾病。研究表明 Ret原癌基因与消化系统、周围及中枢神经系统多种前体细胞的增殖、分化、存活有关。Ret基因长约80 kb，含20个外显子，编码一种酪氨酸激酶受体，它在神经脊源性细胞(周围神经系统的神经节细胞和中枢神经元)中均有表达［2］。Ret基因的编码产物是酪氨酸激酶受体(TKR)，TKR的基本功能是将细跑外信息转化为可传入胞内的化学信号。 Ret突变后使TKR功能受损，活性降低乃至缺乏，从而导致胚胎时期神经节细胞移行受阻，当Ret表达量减少一半时，神经节细胞就不能移行到肠壁内导致HD发生［3］。GDNF是神经营养因子，在中枢和外周神经系统中发挥作用，GDNF家族神经营养因子信号是通过复合受体途径实现的，复合受体由两部分组成，第一部分是糖基化的磷脂酰肌醇(GPl)，为GDNF受体a(GFRa),另一部分为原癌基因 C?ret编码的产物蛋白Ret，它是一种受体酪氨酸激酶， GFRa能特异性地结合 GDNF家族成员，促使Ret磷酸化，导致一系列胞内途径的激活，从而发挥GDNF神经营养因子的生理功能［4］。由于 GDNF是—种膜外蛋白，无法单独进行信号传导，Ret是一种跨膜蛋白，它与GFRa协同作用，共同参与GDNF家族营养因子细胞内外的信号传导。因此，GDNF或Ret的表达缺失，均可导致神经细胞信号传导受阻，疾病发生。目前的研究已证实，Ret基因的突变在家族性HD中约占50%，在散发性病例中约20％。我们采用免疫组化法检测到，Ret阳性表达广泛分布于正常结肠肌间及黏膜下，在移行段Ret的染色强度和量都明显减少，在 HD狭窄段无神经节细胞阳性表达，由于Ret的突变，导致胚胎时期神经节细跑移行受阻，病变肠段肠神经系统发育障碍，从而形成HD。GDNF对于神经系统的发育及营养有重要意义，GDNF促使从胚胎肠独立出来的肠神经前体细胞的生存、增殖及分化，其表达缺陷使神经前体细跑过早凋亡而引起肠神经系统发育障碍。这与我们在HD狭窄段检测不到GDNF表达结果一致。以前HD的诊断全部依赖于X线，难免会出现误诊，给患者带来不必要的伤害，全层活检是 HD组织学诊断的最可靠依据。然而，这种方式需要全身麻醉，并且有发生肠狭窄和穿孔的危险。吸取活检狭窄段肠黏膜和黏膜下层样本是较为安全的方法，已被愈来愈多的医生使用，但由于所取组织较小，黏膜下神经元不典型等因素，存在一定的误诊率，我们研究发现： Ret和GDNF在HD的扩张段强阳性染色，在狭窄的肠管黏膜下无染色，因此在活检肠组织中检测Ret和GDNF蛋白，可以减少HD误诊的发生，是一种创伤小、准确率高的诊断HD方法，为HD手术方案的选择提供最可靠的依据。

【】
  　　［1］ Eng C.The Ret proto?oncogene In multiple endocrine neoplasia type2 Hirschsprung’s disease.［J］.N Engl J Med,1996,335:943?951.

　　［2］ G lovann Romeo,Patrizie Ronchetto,Yinluo,et al.Point mutations affecting the tyrosin Kinase domain of the Ret proto?oncogene in Hirschsprung's disease ［J］.Nature,1994,367(27):377?378.

　　［3］ 管涛，李继承，李民驹，等.人先天性巨结肠Ret基因突变家系研究［J］.中华小儿外科杂志，2003，24（6）：516?517.

　　［4］ Martucciello G Thompson H,Mazzda C,et al.GDNF deficit Hirschsprung's disease［J］.J.Pediatr Surg,1999,33(1):99?102.