实时荧光定量PCR技术检测儿童HBV?DNA载量

                         作者：杨继青，李祚品，廖明凤，陈丽艳

【摘要】  目的:研究儿童HBV?DNA及血清学标志物与乙肝病毒复制的关系，探讨其应用在儿童乙型肝炎患者的临床价值。方法:实时荧光定量PCR测定HBV?DNA;ELISA法酶联免疫吸附法检测血清标志物;速率法检测丙氨酸转氨酶(ALT),综合分析并评价其相互关系及临床联合检测的价值。结果:HBsAg+、HBeAg+、抗HBc+阳性组125例， 检出125例，检出率100%，含量为5.26×106~2.19×108拷贝/ml，ALT 35例增高,占28%;HBsAg+、抗HBe+、抗HBc+阳性组55例，15例被检出，检出率为27.3%,含量范围2.53×103~1.29×106拷贝/ml，ALT 10例增高,占18%;HBsAg+、抗HBc+阳性组10例，检出1例，检出率10%，含量3.19×103拷贝/ml。结论:儿童乙型肝炎患者HBeAg阳性组HBV?DNA载量较高，是否与其生理发育不够完善，机体免疫力低下，对病毒的抵抗力较弱有关。抗HBe阳性组相对复制水平较低，与成人差异无显著，HBV?DNA载量与ALT水平高低无相关性，乙肝病毒含量的高低与肝功能受损程度不呈正相关。

【关键词】  儿童;HBV?DNA;乙肝标志物;丙氨酸转氨酶

    乙型肝炎(HBV)是我国最为常见的感染性疾病之一，目前临床上主要是对成人HBV患者的HBV?DNA与血清标志物研究较多，而专门对儿童HBV患者进行HBV病毒DNA与血清标志物的研究则相对较少。为了解儿童HBV患者HBV?DNA载量与HBV血清标志物(HBVM)的关系，检测抗病毒的有效性，我们采用目前最先进的实时荧光定量PCR技术检测患儿的HBV?DNA载量及HBVM与ALT同时进行检测 。实时荧光定量PCR技术与常规PCR技术相比，其具有特异性更强、能有效解决PCR产物污染问题、准确度高、自动化程度高等特点［1］。我们对本院190例HBV患儿同时进行了HBV?DNA 、HBVM和ALT的测定。探讨不同免疫标志物的儿童HBV患者的血清中HBV?DNA水平及临床价值以及它们之间的相互关系，为临床提供更的治疗依据。

　　1  材料和方法

　　1.1  标本来源 

　　190例儿童HBV患者均来自我院感染科及儿科，空腹12 h，一次性真空采取静脉血4 ml。临床诊断标准均参照2000年全国病毒性肝炎学术会议修订的《病毒性肝炎防治方案》，并经临床及实验室检查排除甲、丙、丁、戊等肝炎，为首次确诊患儿，其中男童101例，女童89例，年龄2岁~14岁，平均年龄9岁。10份对照血清均选自儿童体检者，HBVM五项全为阴性，ALT水平均小于40 u/L。

　　1.2  试剂和仪器试剂
 
　　HBV?DNA采用实时荧光定量PCR法，试剂盒由广州中山大学达安基因股份有限公司提供；条件为:93℃预变性2 min，93℃变性5 s，57℃退火45 s，共40个循环。HBVM采用ELISA法，ALT采用速率法，二者试剂均为上海荣盛生物技术有限公司提供。仪器，扩增仪：瑞士Roche公司LightCyclerTM全自动荧光定量PCR分析仪，仪器数据处理软件5.32版;生化仪：美国雅培全自动生化分析仪(AEROSET)；酶标仪TecanSunrist；洗板机：LabsystemsWen wash4MK2。所有检测项目均严格按照试剂盒说明书操作，HBV?DNA设有阴性对照、强阳性对照、临界阳性对照、质控物和104~107 4种阳性品,所有样本同时扩增,得出所测样本中的载量值用拷贝/ml表示。每次试验中，阴性对照的Ct值(循环阈值)不显示任何数值，阳性参考品的标准曲线的r值介于-0.98~-1。试剂检测下限为1×103拷贝/ml，HBVM :设有阴性、临界阳性和强阳性对照。ALT:设有高、中、低三种质控物。

　　1.3  统计学处理 

　　采用χ2检验和t检验,P<0.05为差异有显著性。

　　2  结果

　　HBsAg+HBeAg+抗HBc阳性组125例，HBV?DNA检出125例，检出率为100%，范围5.26×106~2.19×108拷贝/ml,ALT增高只有35例,占28%;HBsAg+抗HBe+抗HBc阳性组55例,HBV?DNA检出15例，检出率为27.3%，范围在2.53×103~1.29×106拷贝/ml,ALT增高只有10例,占18%;二者HBV?DNA阳性检出率分别为100%和27.3%,差异有显著性(P<0.05)。HBsAg+抗HBc阳性组10例，HBV?DNA检出1例，检出率为10%，结果为3.19×103拷贝/ml，ALT增高为0例。10例儿童健身体检对照者所有检测结果均为阴性。实时荧光定量PCR技术在儿童HBV血清标志物阳性中检测HBV?DNA的结果见表1。表1  不同HBVM儿童HBV患者血清中HBV?DNA平均含量HBV血清标志(略) 注:表内HBV?DNA含量为对数值，*与HBeAg(+)组相比P<0.01。

　　3  讨论

　　血清检出HBsAg是HBV的早期诊断指标之一。HBV感染后，除急性外，大部分人没有临床表现，但在血中可检出HBsAg，这类人通常称为HBsAg携带者。血清HBsAg仅为HBV感染的标志。由于其在血液多为不含病毒颗粒的空壳，故而不反映病毒有无复制、复制程度、传染性强弱及预后。只有进行HBV?DNA定量检测才能了解患者的HBV在体内的复制状况及抗病毒的效果。血循环中HBV?DNA与HBeAg和HBsAg有一定的相关，但其浓度间并不呈正线性相关。HBeAg阳性的标本，HBV?DNA通常有较高的浓度(>105拷贝/ml)，HBeAg阴性、抗HBc阳性的标本，HBV?DNA浓度通常较低(<105拷贝/ml)。当HBV基因组前C区发生突变时，则可出现HBeAg阴性而HBV?DNA仍保持在较高的浓度。单独抗HBc阳性的血液HBV?DNA浓度通常较低。血液循环中HBV?DNA浓度与患者传染性之间的关系，通常如血清HBV?DNA浓度>109拷贝/ml，则在日常生活密切接触中即具有较强的传染性。105~106拷贝/ml，则在日常生活密切接触中的传染性较小。<105拷贝/ml，则在日常生活密切接触中几乎没有什么传染危险性。但不管HBV?DNA的浓度为多少，哪怕是低于相应PCR方法的测定下限，也均会引起输血后的感染［2］。本文对199例HBV患儿的HBV?DNA及HBV血清标志物和ALT的同时联合检测 ，结果表明：125例HBeAg阳性组中，HBV?DNA检出率为100%，而定量值有较高浓度(5.26×106~2.19×108拷贝/ml)。大多数定量值>107拷贝/ml,是否与儿童生理发育不够完善、机体免疫力低下、对病毒的抵抗力较弱有关。HBeAg阳性组患儿的传染性较强,应特别引起重视,注意这类患儿与健康儿童之间的相互密切接触,避免引起交叉感染。55例抗HBe阳性组中，HBV?DNA检出率为27.3%，而定量值与HBeAg阳性组比较相对较低(2.53×103~1.29×106拷贝/ml)P<0.01,但也有少数抗HBe阳性组的HBV?DNA载量较高，可能是HBV发生变异所致，在一段时期内持续较高水平。抗HBc阳性组10例，HBV?DNA只检出1例，阳性率为10%，且载量较低。此类患儿可能是HBV感染恢复后期，此期基本无传染性。三组阳性中，ALT检出均较低，HBV?DNA载量与ALT水平高低无相关性，HBV病毒载量的高低与肝功能受损程度不呈正相关。儿童HBV患者通过进行HBV?DNA、HBV血清标志物和ALT的联合检测，可以综合分析HBV感染状况，特别是进行荧光定量PCR检测HBV?DNA的载量，则能进一步全面了解HBV是否在体内复制、复制程度、传染性的强弱及预后。三项联合检测在儿童HBV患者的早期预防、早期诊断、早期治疗及疗效的观察具有重要的临床价值。

【】
  　　［1］王露楠,李金明,邓巍，等.乙型肝炎病毒DNA定值冻干血清用于荧光定量聚合酶链反应测定的研究［J］.中华检验医学杂志，2004,27(8):523.

　　［2］李金明.乙型肝炎病毒血清标志物测定及结果解释的若干问题［J］.中华检验医学杂志，2006，29(5):385?388.