高效液相色谱法测定肌酐清除率

【关键词】  尿肌苷 肌苷清除率 色谱法

    测定尿中假尿苷排出量时,报道［1，2］多采用其与尿肌苷（UCr）的比值来消除尿液浓缩或稀释对结果的影响。UCr多数以碱性苦味酸(Jatfe法)连续监测法测定,但此法的特异性差,许多有机酸、糖和蛋白质等会产生阳性干扰,基质效应和背景色在强碱中氧化为无色则会产生阴性干扰,为了解这些干扰的程度,我们对Jaffe法测定血清肌苷（SCr）和UCr以及肌苷清除率（CCr）的结果同HPLC法的测定结果进行了比较分析。两法测定SCr的比较已有报道,但尚未见两法测定UCr和CCr的报道。
　　1  材料与方法
　　1.1  仪器和试剂
　　1.1.1  仪器 
　　高效液相色谱仪(包括C?R4A数据处理机、SPD?6AV检测器、LC?9A送液泵、DGU?4A脱气机、CTO?6A柱箱、SCL?6B控制器和SIC?6B自动进样器)为日本岛津制作所产品。CIBA?CORNING EXPRESS PLUS自动生化分析仪为美国康仁公司产品。
　　1.1.2  试剂 
　　肌酐(Cr)标准品为美国Sigma公司产品，Cr测定试剂盒( Jaffe法 )为意大利Sclavo公司产品，其他为国产分析纯试剂。
　　1.2  标准品和样品的制备与前处理
　　1.2.1  标准品 
　　将Cr用重蒸馏水配成浓度为274.6 μmol/L的标准液S1,再倍比稀释为S2、S3…S6。准确吸取上述标准液各100 μl,分别滴加1.9 ml甲醇,漩涡振荡器上混匀,于6000 r/min离心10 min,取上清液1.6 ml于干净试管中，在氮气流下吹干，分析前以流动相300 μl复溶,漩混1 min,自动进样45 μl进行色谱分析。
　　1.2.2  样品(正常对照30例及本院患者23例)  
　　取血清或40倍稀释的24 h混合尿样100 μl,分别滴加1.9 ml甲醇后的处理同标准品。
　　1.3  色谱分析条件 
 
　　分析柱:Shim?pack CLC?ODS 15 cm×0.6 cm;预柱:Shim?pack CLC G?ODS(4);流动相为 0.02 mol/L KH2PO4,用磷酸调至pH 3.2;流速为 1 ml/min;柱温 35℃;AUFS 0.001;波长开始设为233 nm，色谱分析至5.4 min时自动变换为263 nm,至10 min时分析结束,重新设为233 nm,12 min时开始下一试样分析。定量分析前对该条件下的色谱峰进行了充分的定性分析［3］。
　　1.4  Jaffe法 
　　采用动力学法:波长510 nm,时间60 s,样品体积27 μl，试剂体积270 μl。
　　1.5  系列标准液和样品加甲醇处理前 
　　用自动生化分析仪测得Jaffe法结果（0）,处理后先测得HPLC结果(血清和尿液同时测定者CCr),然后再测得处理后(Pre?)的血清和尿样的Jaffe法结果［1］。
　　2  结果
　　2.1  HPLC法和Jaffe法的工作曲线的线性回归方程 
　　分别是Y(浓度)=0.43+0.017X(峰高)和Y(浓度)=-3.11+4417.6X(吸光度差);相关系数分别是0.999 9和0.999 8。
　　2.2  两法结果及参数
　　以HPLC法Cr测定结果为X,以处理前后的血和尿样的Jaffe法Cr测定结果为Y,进行线性回归处理(Y=a+bX),得到参数见表1。表1  两法结果及线性回归参数（略）注:配对t检验;与0（系列标准液和样品加甲醇处理前，用自动生化分析仪测得Jaffe法结果）比较;与1（加甲醇处理后的血清和尿样的Jaffe法结果）比较。
　　3  讨论
　　3.1  从工作曲线的回归方程可知
　　Cr浓度在8.6 μmol/L～274.6 μmol/L范围内,HPLC法的峰高(H)和Jaffe法的吸光度差(ABS)都与Cr浓度成显著的直线关系。
　　3.2  两法测定的血清和尿样以及处理后的血清和尿样结果
　　均显著相关(r=0.889～0.997);血清处理前后HPLC法和Jaffe法结果线性回归方程斜率均与1差异有显著性(P<0.01);而其他与1差异无显著性(P>0.05);HPLC法和Jaffe法结果线性回归方程截矩除未处理试样的CCr与0差异有显著性(P<0.01)外,而其他与0差异无显著性(P>0.05)。两法结果经配对t检验显示除处理后尿样差异无显著性外(P>0.05),血清和尿样以及处理后的血清两法测定结果差异均有显著性(P<0.01),SCr HPLC法测定结果明显较Jaffe法高,与报道［4，5］的结果一致。总而言之血清中除蛋白质的基质效应可使Jaffe法的测定结果偏低外,还有其他影响因素;而尿样中这种影响作用很小，因而HPLC法CCr结果明显较Jaffe法低;两法结果在试样去除蛋白后较未去除蛋白前更接近。
　　3.3  两法测定Cr值比较
　　我们实测HPLC法得到的肌酐清除率(CCr?HPLC)平均相当于Jaffe法(试样不预处理)得到的肌酐清除率(CCr?Jaffe)的87%。这主要是由于血清中Jaffe法测定的Cr比HPLC法所测Cr值偏低，而在尿液中这种偏低的程度更为显著,因此临床评价肾功能时应注意方法的差异。
 
【文献】
  　　［1］何书泉,韩跃武,朱 昕,等.高效液相色谱法同时测定肿瘤患者尿中假尿苷和肌酐的含量［J］.色谱,1995,13(4):288?289.

　　［2］江丽,梁统,凌光鑫,等.恶性肿瘤患者血清和尿中假尿苷检测的意义［J］.实验诊断学,1997,1(3):19?21.

　　［3］彭长华,李承彬,王昌富,等.用紫外?可见光检测器进行色谱峰的光谱分析方法［J］.色谱,1997,15(4):322?323.

　　［4］杨林,徐家明,马玉楠.Jaffe氏法测定血清(浆)肌酐应注意的一个问题［J］.中华医学检验杂志,1989,12(1):1?4.

　　［5］Thienpont L M,Van Landuyt K G,Stockl D,et al.Candidate reference method for determining serum creatinine by isocratic HPLC:Validation with isotope dilution gas chromatography?mass spectrometry and application for accuracy Assessment of routine test kits［J］.Clin Chem,1995,41(7):995?1003.