压力负荷性大鼠肥厚心肌中AngⅡ受体的表达
【关键词】 卡托普利；心肌肥厚；AT1受体；AT2受体
摘要：目的 观察压力负荷性肥厚心肌中AngⅡ受体两种亚型AT1与AT2的表达变化及captopril干预对其表达的影响。方法 选用腹主动脉缩窄方法制造压力负荷大鼠模型，观察压力负荷性大鼠心肌肥厚程度及心肌中AT1与AT2表达的变化。结果 AC术后大鼠左室心肌肥大指数进行性加重，AC术后captopril干预可抑制心肌肥大；心肌中AC组心肌AT1受体的表达随AC的持续时间而不断上升，而AT2的表达仅在AC术后一过性增高，后随着左室负荷的持续而回降到对照水平，AT1/AT2值在AC术后1周时轻度升高，而后进行性降低；血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)AC术后干预在抑制心肌肥大发展的同时，显著抑制了心肌中的AT1表达，使AT1/AT2 值显著回降。结论 持续压力负荷增高引起心肌中AT1表达进行性增高，而对AT2的表达仅表现为早期一过性影响。ACEI干预可显著降低持续压力负荷性心肌中的AT1表达， 从而有效阻止了AngⅡ通过AT1介导启动的心肌肥厚效应。
关键词：卡托普利；心肌肥厚；AT1受体；AT2受体
Expression of AngⅡ receptors in excess loadpressured hypertrophied cardiac muscles of rats
ABSTRACT: Objetive To study the effects of captopri on AT1 and AT2 receptors of loadpressured hypertrophied cardiac muscles of adult rats. Methods Using the methods of narrowing and contraction of the aorta of adult healthy rats to establish the model of animals with hypertrophied cardiac and to observe the changes of receptors AT1 and AT2 of hypertrophied cardiac muscles of AC rats by comprehensive applications of cardiactube,immunity tissue chemistry and the technique of image disjunction. Results Left ventricular and cardiac muscles of rats were increased remarkably as the pressureloading time lasted. After using captopri, left ventricular hypertrophied one was decreased more significantly than that in control group. The expression of receptor AT 1 was increased remarkably as the pressureloading time lasted. The expression of receptor AT2 was increased transiently, after that reached about as high as control group. AT1/AT2 was increased one week after operation, and then was progressively decreased. After AC, captopri prevented hypertrophied cardiac muscles and receptor AT1 in cardiac muscles. AT1/AT2 was remarkably decreased. Conclusion Loadpressured cardiac hypertrophy may increase the expression of AT1. The expression of receptor AT 2 was increased transiently. The main working mechanism of captopris preventing and treating the loadpressured cardiac hypertrophy in adult rats may be lowering the expression of AT1 and may effectively block the cardiac hypertrophy regulation precess of Ang ll via AT1 preventing loadpressured cardiac hypertrophy in adult rats.
KEY WORDS: captopril; cardiac hypertrophy; AT1 receptor; AT2 receptor
持续压力负荷过重诱发的心肌改建、心室重构是心血管疾病中发病率最高的高血压引发心肌受损乃至心力衰竭的中心发病环节，而持续压力负荷激活心肌组织肾素血管紧张素系统(renin angiotensin system, RAS)使心肌内源性血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)持续高表达是这一病理变化的重要调控机制。AngⅡ通过心肌组织中的特异受体作用于心肌和心肌间质细胞，从而调控心肌改建。目前，已知心肌中AngⅡ的主要受体为1型受体(AT1)和2型受体(AT2)[1]，现有的研究显示AngⅡ的促心肌肥大效应主要是通过AT1受体所介导的[2]，而成年心肌中AT2受体的作用尚未阐明。已有的报道提示AT2对心肌改建显示出复杂的影响[3]，其基本尚未揭示。持续压力负荷对心肌组织中AngⅡ受体的表达有何影响？应用血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor, ACEI)在降低心肌组织中AngⅡ表达[4]的同时，是否会对AngⅡ受体表达产生影响？这些有关揭示心肌改建发生及其防止机制的问题都尚不清楚，需要深入研究。
1 材料与方法
1.1 动物模型复制及分组 本实验选用成年、健康、雄性SD大鼠，体重230-270g，由西安大学医学院实验动物中心提供。采用我室改进的大鼠腹主动脉缩窄手术(aortaconstruction, AC)制作压力负荷性动物模型。大鼠麻醉后(戊巴比妥钠15mg/kg 腹腔注射，氯胺酮50mg/kg肌肉注射)沿腹中线开腹，将肠管轻轻推开，暴露、打开后腹膜，于右肾动脉上方分离出约3mm长的腹主动脉。眼科镊从下方托起腹主动脉套上一内径为0.8mm的银夹，使腹主动脉形成环形缩窄。假手术对照组除在分离的腹主动脉上放置银夹外，其余操作均同手术组。实验动物常规饲养2d以服习，然后随机分为7组：假手术1周组(SO1WK)、3周组 (SO3WK)、6周组(SO6WK)； 腹主动脉缩窄1周组(AC1WK)、3周组(AC3WK )、6周组 (AC6WK )和主动脉缩窄后captopril干预组(AC+Cap)。
1.2 ACEI干预方法 选用captopril原料药(由常州制药厂提供)，AC+ Cap组第4周开始药物干预。术后观察统计大鼠每天平均饮水量，按每只大鼠每天平均饮水量将captopril溶于自来水中，以自由饮水方式给药，每日更换新鲜配制的含药饮用水，每只大鼠平均服药量约为75mg/(kg・d)，干预时间为3周。非干预手术组和假手术组均给予不加药的同量自来水。
1.3 主要试剂和设备 美国Sigma公司生产的多聚赖氨酸(polyllysine)；武汉博士德公司生产的兔抗鼠AT1受体多抗 、兔抗鼠AT2受体多抗；OLYMPUS显微镜系日本OLYMPUS公司产品；显微镜目镜测微尺系上海第三光学仪器厂产品；显微机图像分析系统为美国Diagnosti Instruments公司产品。
1.4 血浆与血清的制备 实验动物饲养到观察时间点时用10g/L戊巴比妥钠迅速麻醉大鼠(45mg/kg腹腔注射麻醉)，称体重，开腹后立即从腹主动脉采血6mL，其中3mL血液置于含抗凝剂(0.3mol/L EDTANa2，0.34mol/L 8羟基喹啉和0.32mol/L的二巯基丙醇)的试管中，于4℃、4000g×15min离心，分离出血浆以250μL为一个包装保存于eppendoff管，标记后-20℃冰箱保存待测；另外，3mL血液置于无热源试管中，静置血液凝固后于4℃离心分离血清，以100μL为一个包装，保存于eppendoff管，标记后，-20℃冰箱保存待用。
1.5 心肌细胞横径的测量 开胸摘取心脏在预冷(0-4℃)的生理盐水中洗去心腔中残血，用滤纸将心脏表面水吸干，沿冠状面于心脏最大横径处分别切取约3mm厚的左室及右室壁心肌，常规制作HE切片。在HE切片上，用显微镜目镜测微尺测量左室心肌细胞横径(left ventricular transection diameter, LVTDM)和右室心肌细胞横径(right ventricular transection diameter, RVTDM)。每张切片先在低倍镜下观察左室游离壁，然后高倍镜下(10×40)在心肌纵断面随机选取30个胞浆横纹清晰、胞核完整、形状规则的心肌细胞，测量有核处横径，取其均值为该例的LVTDM。右室壁测量10个符合上述标准的心肌细胞,求其均值为该例的RVTDM。
1.6 检测心肌AT1受体与AT2受体的表达 依Elivision法进行免疫组织化学染色。常规石蜡切片经脱蜡水化、灭活内源性酶、抗原修复、血清封闭、分别滴加一抗及二抗、DAB显色、复染和透明，最后封片。采用计算机图象分析系统(diagnostic instruments) 对免疫组化染色切片进行计量分析。随机从每张切片左上、左下、右上、右下和中部采集5个区域计算每视野阳性染色的积分光密度值(integrated optical density, IOD)对免疫组化进行定量分析，计算心肌组织中AT1及AT2的表达量。
1.7 实验资料的统计学处理 采用SPSS10.0统计软件(SPSS for Windows 10.0)对所得数据进行分析，各组数值以均数±标准差表示。实验组和对照组之间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各实验组心肌细胞横径的变化 腹主动脉缩窄术后心肌细胞横径的变化见图1和表1。
图1 SO6WK、AC6WK、AC+Cap组心肌组织的HE染色（略）
Fig.1 Cardiac muscle tissues HE stainin (×400)
A: SO6WK; B: AC6WK; C: AC+Cap; SO: sham operation; AC: aortaconstruction; Cap: captopril
表1 各实验组心肌细胞横径的变化（略）
Table 1 Transection diameter in different groups (±s)
SO: sham operation; AC: aortaconstruction; Cap: captopril;*P<0.05, **P<0.01 vs. SO; #P<0.05, ##P<0.01 vs. AC1WK; ▲P<0.05 vs. AC3WK; △P<0.05 vs. AC6WK; LVTDM: left ventricular transection diameter; RVTDM: right ventricular transection diameter
表1显示，假手术组左右心室心肌细胞横径均有随年龄而轻度增大的趋势，但各组间无显著性差异(P>0.05)。AC术后1、3、6周时LVTDM与各自对照组相比均明显增大(P<0.05，P<0.01)，且各组间呈现进行性递增现象(P<0.05)。实验结果表明腹主动脉缩窄所致的持续左心室压力负荷增高，引起左室心肌细胞横径进行性增大。AC+Cap组LVTDM显著低于AC6WK组(P<0.05)而高于SO6WK组(P<0.01)，同AC3WK组相比无显著性差异。RVTDM在AC各组间有递增的趋势 ,虽相邻两组间无显著性差异，但AC6WK组已显著高于AC1WK组(P<0.05)。结果表明，腹主动脉缩窄术后1周左室心肌细胞已发生明显肥大，在实验观察的6周内呈现进行性加重。同时，右心室心肌细胞横径也随着压力负荷作用时间的持续而轻度增大。腹主动脉缩窄后3周在已发生明显左室心肌细胞肥大时，给予captopril干预3周，抑制了左室心肌细胞肥大的继续发展。
2.2 AC术后心肌细胞AT1和AT2的表达变化 组化染色心肌AT1 、AT2阳性细胞后显示胞膜及胞浆内有棕黄色颗粒状阳性产物(图2、图3)，阳性弱时呈淡黄色，阳性强时呈深褐色。AT1及 AT2在各实验组心肌均有表达。压力负荷增加后，肥大心肌中AT1和 AT2的表达变化见表2 。
表2 各实验组心肌细胞AT1和AT2的表达变化及AT1/AT2值（略）
Table 2 The expression of receptor AT1 and AT2, and AT1/AT2 of cardiac muscle cells in different groups
SO: sham operation; AC: aortaconstruction; Cap: captopril; *P<0.05, **P<0.01 vs. SO; #P<0.05, ##P<0.01 vs. AC1WK; △P<0.05, △△P<0.01 vs. AC6WK
表2显示AC术后心肌中AT1 表达呈现进行性增高，AC术后6周心肌AT1表达已较对照组高出近5倍，而心肌中AT2的表达仅在AC术后1周时表现为一过性升高，随后即回降到对照水平。AC术后3周captopril干预则显著降低了肥大心肌中AT1的表达，6周时其虽仍高于对照水平，但已显著低于AC术后3周的水平(P<0.01)。而AC术后 captopril干预对心肌中AT2的表达无明显的影响。AT1/AT2值在AC术后1周时明显降低，而术后3周、6周时各组间呈现进行性递增现象(P<0.05)。结果表明腹主动脉缩窄所致的持续左心室压力负荷增高，激活了心肌细胞，使AT1表达上调，且在实验观察的6周内呈现进行性增高。AC术后早期引起心肌细胞AT2表达一过性上调，随着左室负荷的持续增高，AT2表达很快回降到对照水平。本实验剂量captopril干预在抑制压力负荷性心肌肥大的同时，不仅抑制且逆转了心肌中AT1的表达，但对心肌中AT2的表达无明显影响。
图2 AC1WK、AC6WK、AC+CAP组心肌细胞AT1的免疫组化染色（略）
Fig.2 Cardiac muscle cells of AT1 tissue chemistry stainin (×400)
A: AC1WK few brown yellow grain; B: AC6WK few brown yellow grain; C: AC+Cap few brown yellow grain, but AC+Cap less than AC6WK
图3 AC1WK、AC6WK、AC+CAP组心肌细胞AT2的免疫组化染色（略）
Fig.3 Cardiac muscle cells of AT1 tissue chemistry stainin (×400)
A: AC1WK A few brown yellow grain; B: AC6WK few brown yellow grain; C: AC+Cap few brown yellow grain; AC: aortaconstruction;Cap: captopril
3 讨论
现有的研究显示，AngⅡ与心肌细胞及心肌间质细胞膜的AT1受体特异性结合，而激活细胞，使其表型改变，引发心肌细胞肥大及心肌间质增生，从而导致心肌改建、心室从构。AngⅡ与AT1受体的结合激活了膜上的G蛋白，从而改变了磷脂酶C(PLC)的活性[56]，加速细胞中磷脂酰肌醇(PLG3)的水解，生成磷酸肌醇(IP3)和甘油二酯(DG)[5]。IP3可激活肌浆网，释放Ca2+增多，一方面使游离Ca2+浓度增高，加强心肌兴奋收缩耦联，使心肌收缩力增强；另一方面通过特异的离子流激活核基因及增加胞浆蛋白合成。AT1受体活化通过一系列传导生长因子信号的调节链，激活原癌基因表达，启动细胞增殖、肥大，导致心肌肥厚[9]。在对仅表达AT1的细胞研究显示，AngⅡ可激活细胞外调节激酶(ER)，通过酪氨酸激酶系统导致有丝分裂或肥大反应。在发生心肌肥厚时的心脏内，AT1受体的含量明显上调[6]。本试验证实，AC术后AT1的IOD值在1、3、6周时呈现进行性升高。显示AC术后随着心肌压力负荷时间的延长，心肌AT1表达呈现进行性递增现象。压力负荷增高不仅激活了心肌中RAS系统，使心肌中促生长活化因子AngⅡ增多，同时使心肌中AngⅡ促生长转导通路的受体AT1表达上调，从而使AngⅡAT1转导通路成为此时调控心肌改建的主要通路。已有的研究认为AT2受体在胚胎发育及幼年生长中发挥着重要的调控作用，而对其在成年体内的表达及其作用尚不明了[7]。在对仅表达AT2的肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PCW12)的研究中发现AT2激活磷酸酪氨酸磷酸酶(PTP)，从而抑制增殖和促进分化[8]。在采用离体灌注AT2过度表达小鼠的心脏研究中发现，AT2活化明显地抑制了AT1介导的ERK活性效应。目前多数报道认为成年心肌中AT1与AT2受体呈现相互拮抗的调节效应，故一些学者推测心肌肥厚时AT2表达变化可能与AT2 代偿性的调节AT1与AT2的平衡有关[9]。有报道认为，主动脉缩窄导致心肌细胞肥大时心肌中AT2表达不变，但有不同程度的AT1/AT2比率改变。而Lee和Kijima[10]分别采用自发性高血压大鼠、犬等心肌肥厚模型，观察到肥大的心肌细胞AT1和AT2受体mRNA及蛋白质表达均增加，而AT1/AT2比率下降。总之，关于AT2在心肌改建过程中的变化及其病理生理意义尚未定论，需更进一步深入研究。本试验结果显示，各对照组成年大鼠心肌AT2均有低水平表达，实验观察过程中无明显变化。AC术后1周，组织化学测定显示AT2表达显著升高，较对照组相比增高约3倍。但是，随着左室负荷的持续而逐步回降，3周、6周组与对照组已无显著性差异。表明腹主动脉缩窄所致的持续左心室压力负荷增高，早期引起心肌细胞AT2表达呈一过性上调，且随着左室负荷的持续增高AT2表达很快回降到对照水平。压力负荷增高引起心肌AT2表达一过性增高的病理生理意义尚待深入研究。有研究者分析认为，AT1/AT2值能更准确地反映RAS系统在组织改建中的效应。本实验显示AC早期随着AT2表达的一过性上调使心肌中AT1/AT2值轻度降低，以后随着AT1表达的不断升高而AT2的表达回降，则心肌中AT1/AT2值进行性增高。AC术后3周时AT1/AT2值增高达对照水平约2倍，6周时达对照水平6倍。压力负荷持续增高中后期心肌组织中AT1/AT2值持续增高，表明此时心肌中RAS系统仍主要是通过AngⅡAT1轴发挥其调控效应，即压力负荷性心肌改建过程中AT1受体仍是其膜传导系统的关键感受器。因而，AT1阻滞剂的持续使用，可在压力负荷性心肌改建防治中发挥良好效应。血管紧张素转换酶(ACE)是RAS系统中关键组分之一[11]，促使AngⅠ转变为AngⅡ。ACE属二肽基羧肽酶,其正式名称为肽基二肽水解酶(peptidyldipeptide hydrolasa)，存在于血管内皮细胞、上皮细胞和多种细胞膜上，其在肺组织中的含量高于其他组织。ACE在细胞内合成，既可与膜结合，也可存在于细胞内和分泌到细胞外[12]。ACEI是上世纪70年代发现的有效降压药物。基础与临床研究均证实，除降压外ACEI对心肌改建与心力衰竭也显示出良好的防治效应。已有的研究认为，ACEI显著减低了心肌中的AngⅡ的过渡持续生成，这是其防治心肌改建与心力衰竭的主要机制。本研究显示，在持续压力负荷增高过程中给予ACEI，能明显抑制心肌中AT1的过渡表达，而对AT2的表达无明显影响。从而揭示，ACEI除降低压力负荷性心肌AngⅡ水平外，同时降低心肌中AT1的表达。这也是其防治压力负荷性心肌改建机制的重要作用点。
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