血红素氧合酶
【关键词】 血红素氧合酶
摘要：目的 探讨血红素氧合酶1(HO1)对肝硬化大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用。方法 将大鼠随机分为：正常组(N组)、硬化组(LC组)、假手术组(S组)、手术组(I/R组)和给药组(I/R+hemin组)。除正常组外其余各组大鼠皮下注射体积分数为40%的CCl4溶液，每周2次，11周后形成肝硬化模型；停药1周后进行肝脏缺血再灌注；于再灌注后6h检测肝功能、抗氧化能力，免疫组织化学检测核转录因子(NFκB)、天冬半胱酶(caspase3)和HO1蛋白的表达。 结果 给予hemin诱导HO1高表达能减轻肝脏缺血再灌注后肝细胞损伤，提高锰超氧化物歧化酶(MnSOD)水平，降低caspase3、NFκB阳性表达。结论 HO1能有效地减轻肝硬化肝脏缺血再灌注损伤，其机制可能与提高MnSOD水平、降低caspase3及NFκB表达有关。
关键词：血红素氧合酶1；肝脏缺血再灌注；NFκB；caspase3
Protection of heme oxygenase1 against hepatic ischemia reperfusion injury in cirrhotic rats
ABSTRACT: Objective To study the proctective effect of heme oxygeanse1(HO1) on cirrhotic rats after hepatic ischemia reperfusion injury. Methods All the rats were randomly divided into 5 groups as follows: normal group(N), liver cirrhosis group (LC), sham operation group (S), ischemia reperfusion group (I/R), and I/R+hemin group. Except for N group, the other groups were injected with 40% CCl4 twice a week. After 11 weeks, the model of liver cirrhosis was formed. The segmental (70%) hepatic ischemia reperfusion operation was carried out one week later. The animals were sacrificed 6h after reperfusion. Blood was collected to measure the liver function, antioxidative ability, NFκB and caspase3, and HO1 expressions were studied by immunohistochemistry method. Results Administration of hemin to induce high HO1 expression could lessen hepatic injury, increase MnSOD enzyme level, and decrease caspase3 and NFκB expresssion. Conclusion HO1 plays an important role in protecting liver cirrhosis against ischemia reperfusion injury by increasing MnSOD enzyme level and decreasing expression of caspase3 and NFκB.
KEY WORDS:heme oxygenase1; hepatic ischemia reperfusion; NFκB; caspase3
上消化道大出血、肝脏外科手术等过程中都经历肝脏缺血再灌注(ischemia reperfusion, I/R)损伤这一临床常见的病理变化过程。肝硬化时肝脏对缺血再灌注损伤更加敏感。近年人们发现血红素氧合酶1(heme oxygenase1, HO1)对肝脏缺血再灌注损伤有保护作用[1]。本实验采用大鼠肝硬化肝脏缺血再灌注模型，观察诱导HO1表达后肝组织caspase3、核转录因子κB(nuclear factorkappB, NFκB)及HO1的变化，探讨HO1对肝硬化肝脏缺血再灌注的保护机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 健康雄性SD大鼠，体重200-250g，由西安大学医学院实验动物中心提供。将大鼠随机分为：正常组(N组)、硬化组(LC组)、假手术组(S组)、手术组(I/R组)和给药组(I/R+hemin组)。正常组和硬化组：入腹后直接取血和肝组织，不阻断肝门血供。假手术组：入腹后只分离肝十二脂肠韧带，不阻断肝门血供。手术组：游离肝十二脂肠韧带，分清供应肝左叶和中叶的肝蒂，肝脏缺血30min，再灌注6h。给药组：术前24h和12h给大鼠腹腔注射氯化铁血红素(hemin)，每次0.3mmol/kg(30μmol/100g)，其余操作同手术组。其他各组给予等量生理盐水腹腔注射。正常组每组6只大鼠，其余各组或亚组9-12只大鼠。
1.2 主要试剂 CCl4分析纯购自西安富力化学厂，橄榄油分析纯购自国药集团化学试剂有限公司，hemin购自美国Sigma公司，超氧化物岐化酶(SOD)、丙二醛(MDA)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，抗大鼠NFκBp65、caspase3和HO1一抗购自武汉博士得生物工程公司，即用型快速免疫组化MaxVisionTM试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。
1.3 模型制备
1.3.1 肝硬化模型的制备 除正常组外其余各组大鼠皮下注射体积分数为40% CCl4溶液(由2份CCl4和3份橄榄油混合而成)，首剂5mL/kg，以后每次3mL/kg；正常组大鼠皮下注射等体积生理盐水，每周2次，共11周。随机抽取大鼠做肝组织HE染色和Masson染色证实肝硬化形成，造模成功后1周用于实验。
1.3.2 肝脏缺血再灌注模型的制备 大鼠术前禁食12h，氯氨酮(0.8g/kg)腹腔注射麻醉大鼠，上腹正中切口，游离肝十二指肠韧带，用无创微血管夹夹闭供应肝左叶和肝中叶的肝动脉、门静脉及胆管，造成70%肝脏缺血。不阻断肝尾叶和肝右叶血流，以防门静脉和胃肠道淤血。30min后松开微血管夹恢复肝脏灌流，关腹后独笼饲养。
1.3.3 hemin溶液的配制 称取少量hemin，溶于0.1mol/L NaOH溶液中，再用1mol/L HCl调pH至7.4，最后用生理盐水稀释至终质量浓度5g/L。临用前新鲜配制，避光保存。
1.4 实验方法
1.4.1 采集标本 各组动物实验结束后，再次麻醉大鼠，二次开腹，取下腔静脉血6-8mL，常温下1500r/min离心5min，取血清低温保存。取左叶肝组织约0.4cm×0.5cm×1.0cm固定于40g/L多聚甲醛溶液中，石蜡包埋，5μm厚连续切片。
1.4.2 血清学检查 丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)由本院生化室全自动生化分析仪测定。MnSOD、MDA采用南京建成公司SOD、MDA检测盒进行测定。
1.4.3 免疫组织化学检测及结果判定 肝组织石蜡切片采用即用型快速免疫组化MaxVisionTM试剂盒检测NFκB、caspase3和HO1蛋白的表达。一抗工作浓度分别为1∶300、1∶100和1∶100。用磷酸盐缓冲液代替一抗作为空白对照，用已知阳性反应的组织作为阳性对照。采用德国LEICA公司的QWin550CW图像信号采集与分析系统对切片阳性部位进行灰度分析，灰度值越低，表明蛋白表达量越高。
1.5 统计学处理 所有数据均用均数±标准差(±s)表示，采用SPSS13.0统计分析软件进行单因素方差分析，以全体P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 血清ALT、AST活性测定 LC组血清ALT、AST活性较N组明显升高(P<0.01)。肝脏缺血再灌注6h后，I/R组、I/R+hemin组血清ALT、AST活性迅速升高，与S组相比差异均有统计学意义(P<0.01)。I/R+hemin组与I/R组相比，酶活性降低，其差异也具有统计学意义(P<0.01，表1)。
2.2 血清MnSOD、MDA含量测定 与N组比较，LC组MnSOD水平降低，MDA水平升高(P<0.01)。肝脏缺血再灌注后6h时I/R组及I/R+hemin组MnSOD均低于S组，MDA高于S组(P<0.01)，但给予hemin再灌注后MnSOD水平高于同期I/R组，MDA水平低于I/R组(P<0.01,表1)。
表1 肝脏缺血再灌注6h时血清学指标（略）
Table 1 The level of serum enzymes after 6h of hepatic ischemia
N: normal group; LC: liver cirrhosis group; S: shamoperation group; I/R: ischemia reperfusion group; I/R+hemin: given hemin before ischemia reperfusion group; #P<0.01 vs. N group; △P<0.01 vs. S group; ▲P<0.01 vs. I/R group
2.3 肝组织NFκB、caspase3免疫组化结果 NFκB、caspase3在N组肝组织中几乎没有表达，在LC组和S组呈弱阳性表达。肝硬化大鼠肝脏缺血再灌注后6h，I/R组NFκB、caspase3表达比S组明显升高(P<0.01)。I/R+hemin组再灌注6h时NFκB、caspase3表达比同期I/R组明显下降(P<0.01，表2、图1、图2)。
2.4 肝组织HO1免疫组化结果 HO1在N组无表达，LC组和S组有少量表达。再灌注6h时I/R组HO1表达多于S组(P<0.01)。I/R+hemin组HO1表达比同期I/R组明显增多(P<0.01，表2、图3)。
表2 肝脏缺血再灌注后6h NFκB、caspase3、HO1灰度测量结果（略）
Table 2 The gray level of NFκB, caspase3 and HO1 protein after 6h of hepatic ischemia
N: normal group; LC: liver cirrhosis group; S: shamoperation group; I/R: ischemia reperfusion group; I/R+hemin: given hemin before ischemia reperfusion group; #P<0.01 vs. N group; △P<0.01 vs. S group; ▲P<0.01 vs. I/R group
图1 NFκB在肝组织中的表达（略）
Fig.1 The expression of NFκB in the liver (×400)
A: I/R group; B: I/R+hemin group
图2 Caspase3在肝组织中的表达（略）
Fig.2 The expression of caspase3 in the liver (×400)
A: I/R group; B: I/R+hemin group
图3 HO1在肝组织中的表达（略）
Fig.3 The expression of HO1 in the liver (×400)
A: I/R group; B: I/R+hemin group
3 讨论
肝脏缺血再灌注损伤是临床常见的病理变化过程，目前认为其发生机制可能与炎性细胞因子、细胞凋亡、氧自由基、微循环障碍、细胞内钙超载等有关[23]。近年来发现HO1对肝脏缺血再灌注损伤有保护作用，其作用机制可能与其催化血红素及其降解产物有关[4]。临床上发生上消化道大出血、肝移植、肝切除的患者多有肝硬化基础存在，HO1是否对肝硬化肝脏IR损伤有保护作用，国内外少有报道。因此应进一步研究HO1在肝硬化状态下肝脏缺血再灌注中的作用。HO是催化血红素(heme)分解生成一氧化碳(CO)、胆绿素(biliverdin)和Fe2+的限速酶。HO包括3种亚型：诱导型HO1、结构型HO2、未确定型HO3。HO1及其产物有抗氧化应激、抗凋亡、抗炎症及改善微循环等作用，被认为是减轻肝脏缺血再灌注损伤的一种新的方法[5]。HO1的产物CO能降低促炎基因表达而提高抗炎基因表达，减轻炎症反应。CO还能抑制血管平滑肌增殖、抑制血小板聚集、抵抗细胞凋亡[67]。HO1的另一产物胆绿素，是较强的氧化剂，能减轻内皮细胞中黏附分子的表达，抑制炎粒细胞和炎性巨噬细胞聚集，提高抗凋亡分子的表达[8]。SOD是体内普遍存在的超氧化物歧化酶，其基本功能是保护细胞免受氧化应激，通过歧化反应清除超氧自由基。SOD可分为3种类型：铜锌SOD(CuZnSOD)存在于细胞浆，锰SOD(MnSOD)存在于线粒体，还有细胞外SOD，存在于关节腔、脑膜腔积液等。MnSOD具有抗氧化能力。本研究中诱导HO1后MnSOD升高，表明HO1能提高体内抗氧化能力。这与学者Marczin[9]利用腺病毒基因转移技术发现MnSOD高表达能减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的研究结果一致。NFκB是调节基因转录的关键因子之一[10]，在缺血再灌注中发挥重要作用。NFκB活化后能促进细胞因子(TNFα、IL1、IL6)、化学因子(IL8、MIP1α)及黏附分子(ICAM1、VCAM1、E选择素)的转录表达，这些炎症介质再以单个或状形式引起肝脏损伤[1112]。本研究结果显示肝脏缺血再灌注6h时I/R+hemin组NFκB表达低于I/R组，推测HO1能降低NFκB减轻炎症反应，减轻肝脏损伤。以往认为肝脏缺血再灌注损伤时细胞以坏死的形式发生死亡，但如今发现细胞凋亡在其过程中也起重要作用，凋亡已成为当前研究肝脏缺血再灌注损伤发病机制的热点之一[13]。凋亡是细胞在各种死亡信号刺激后发生的一系列瀑布式激活的一种特殊的细胞死亡方式，其过程可分为3个阶段：第一阶段是起始阶段，细胞接受死亡信号刺激；第二阶段是活化阶段，包括线粒体释放细胞色素C、凋亡诱导因子形成、procaspase2、3、9活化等；第三阶段的标志是下游效应分子caspases的活化阶段，此阶段细胞皱缩，染色质聚集，细胞核断裂，细胞膜肿胀，细胞变为凋亡小体。caspases是一组天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶，该家族蛋白酶的级联活化是细胞凋亡程序的主要运行方式[14]，其中caspase3被认为与凋亡关系最为密切，它是凋亡途径下游底物酶解的关键分子，被称为“凋亡的执行者”[15]。本实验研究发现肝脏缺血再灌注后，caspase3表达明显升高，且I/R+hemin组中caspase3表达低于I/R组，提示肝脏缺血再灌注损伤后确实发生细胞凋亡，而且HO1可能通过减轻细胞凋亡来减轻肝脏缺血再灌注损伤。本研究还发现用hemin诱导体内HO1表达增高后，与缺血再灌注组相比，其血清转氨酶水平、脂质过氧化产物MDA水平降低，NFκB、 caspase3表达减少，具有抗氧化能力的MnSOD升高，提示HO1可能通过减轻炎症反应、抵抗凋亡、减少氧自由基和提高机体抗氧化能力，对肝硬化肝脏缺血再灌注损伤发挥保护的作用。迄今为止，HO1被认为在许多病理生理过程中发挥重要作用，如缺血再灌注损伤、动脉粥样硬化、支架置入术后再狭窄、肝硬化、阻塞型肺疾病等，但其具体作用机制有待进一步研究，希望通过HO1找到一条减轻肝硬化肝脏缺血再灌注损伤的新途径。
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