急性移植物抗宿主病病人Th细胞亚群变化及其临床意义

       作者：王书红,达万明,靳海杰,靖彧,苏荣,阮秀霞

【摘要】  本研究探讨异基因造血干细胞移植（allo?HSCT）后急性移植物抗宿主病（aGVHD）时Th细胞亚群的数量变化及其临床意义。观察了23例allo?HSCT患者aGVHD的发病情况， aGVHD的诊断主要依据临床表现，对部分病例进行了皮肤活检，取得病依据。移植前后定期采集23例患者的外周血，采用流式细胞仪检测其Th细胞亚群Th1、Th2细胞比例的变化。结果表明： 23例患者8例发生了aGVHD，其中3例Ⅰ度，2例Ⅱ度，3例Ⅲ度aGVHD， 15例未发生aGVHD。流式细胞术检测显示，发生aGVHD患者的Th1细胞量明显高于未发生aGVHD患者（p<0.01），Ⅱ-Ⅲ度aGVHD患者Th1细胞的IFN?γ表达明显高于未发生aGVHD患者（p<0.01），而Th2细胞的IL?4表达明显低于未发生aGVHD患者，动态观察发现在aGVHD发生前和发生后未的患者Th1细胞明显增高，治疗后明显下降，而未发生aGVHD的患者移植前后Th1细胞量变化不大。结论： 发生aGVHD患者Th1细胞明显增多，且这种增多与aGVHD有关。因此，移植后早期动态监测Th细胞亚群Th1量的变化有助于aGVHD的诊治。

【关键词】  急性移植物抗宿主病

     Quantitative Change of Th Cell  Subsets in Patients with Acute Graft?versus?Host Disease  and Its Clinical Significance

       Abstract    This study was purposed to investigate the change of  Th cell subsets  in the patients  with  acute graft?versus host disease （aGVHD） and to explore its role in the pathogenesis of aGVHD after allogeneic  hematopoietic stem cell transplantation（allo?HSCT）.  23 patients underwent allo?HSCT were selected for analysis. The aGVHD in patients was  diagnosed according to clinical features, and was  confirmed by skin  biopsy in some patients. The peripheral blood from  23 patients was collected before and after allo?HSCT. The quantitative chenges of Th1 and Th2 cells in peripheral blood samples were detected by using flow cytometry. The results showed that out of 23 patieats the  aGVHD occured in 8 patients including 1 case of  grade  Ⅰ, 2 case of  grade  Ⅱ, 3 cases of  grade  Ⅲ; no aGVHD occured in 15 patients. The flow cytometry analysis revealed that the amount of Th1 cells in patients with aGVHD was much higher than that in patients without aGVHD  （p<0.01）, the IFN?γ expression of Th1 cells in patients with  aGVHD  of grad Ⅱ-Ⅲ  significantly was higher than that in patients without aGVHD (p<0.01), meanwhie the IL?4 expression of Th2 cells in patients with   aGVHD of  grade Ⅱ-Ⅲ  was significantly lower than that in patients without aGVHD (p<0.05). Dynamical detection indicated that the Th1 obviously increased before occurrence of aGVHD  and before  treatment  of  aGVHD, while the Th1 cells obviously decreased after treatment  of  aGVHD. The  Th1 cells not changed significantly in patients without aGVHD  before and after allo?HSCT. It is concluded that Th1 cells obviously increase in patients with aGVHD, this increase is related to aGVHD  pathogenesis.  Detecting the changes of  Th cell subsets in the early stage after  allo?HSCT may be contributed  to early diagnosis and therapy of aGVHD.

    Key words    acute graft?versus?host disease;  allogeneic hematopoietic stem cell transplantation;  Th1 cell;  Th2 cell

    急性移植物抗宿主病（aGVHD）是异基因造血干细胞移植（allo?HSCT）的主要并发症之一，发生率高达30%-60%，并造成约20%的移植相关死亡率，严重影响患者的生存时间和生存质量［1］。因此，aGVHD的发病机理研究是当今移植免疫的重点课题。aGVHD发生的中心环节是供者来源的T细胞识别受者的异体抗原而被激活，过量释放细胞因子而引起受者多器官的损伤。目前临床尚缺乏能够直观，及时反映患者免疫状态变化的手段，因此研究可能引发aGVHD的Th细胞亚群的变化，对于更好的早期防治aGVHD具有重要的实际意义。

    材料和方法

    临床资料及研究对象

    所选择的23例异基因造血干细胞移植患者均为2002年2月至2004年3月在我院诊治的恶性血液病患者，其中慢性粒细胞白血病 8例（慢性期 6例、加速期2例），急性非淋巴细胞白血病 10例，（完全缓解8例，M5原发耐药未缓解 1例，M6复发1例），骨髓增生异常综合征 2例（RA 1例、RAEB?T 1例），急性淋巴细胞白血病完全缓解2例 ，淋巴瘤（NHL/ALL）中枢受累1例。23例患者中21例接受了异基因外周血干细胞移植，2例接受了异基因骨髓移植。供受者HLA配型均完全相同，同胞供者21例，非亲缘供者2例（骨髓来自省慈济骨髓库）。供者外周血造血干细胞动员应用惠尔血300 μg/d，皮下注射，2次/日，第5、6天采集造血干细胞。患者采用经典Cy+TBI进行预处理：环磷酰胺60 ｍg/(kg·d)，连用2天,全身照射6-10 Gy，分2天进行，肺受照剂量<8 Gy，2例接受非血缘关系供者骨髓移植患者采用马利兰+阿糖胞苷+环磷酰胺方案预处理。aGVHD的诊断及分级参照美国西雅图Fred Hutchinson癌症研究中心Thomas等于1975年提出的分级诊断方法。有7例患者进行了皮肤活检以取得病理学证据。预防方案：采用环孢霉素（CsA）以及短疗程氨甲喋呤（MTX）方案。MTX的用法：移植后第1天15 mg/m2静脉滴注，移植后第 3、6、11天改为10 mg/m2； CsA用法：1.5-2 mg/(kg·d)24小时持续静脉滴注，移植前1天至移植后30天，每周检查环孢霉素A血药浓度，并根据血药浓度调整用药剂量，直至患者无严重胃肠症状后改为口服(3 mg/kg)，依据情况维持或减量。治疗aGVHD应用甲基强的松龙120 mg/d静脉滴注，好转后改为口服。

    标本收集

    按静脉采血常规，定期采集患者的外周血3 ml，肝素抗凝备检。采血时间分别为：①移植前7天，移植后第7、14、21、28天；②移植1月后若患者发生aGVHD随时抽取外周血检查。

    主要试剂

    抗人CD4?Pc5(mouse IgG1,13B8.2)购自美国Coulter?Immunotech公司。抗人IL?4?PE(mouse IgG1,8D4?8)、抗人IFN?γ?FITC((mouse IgG1κ,4S.B3),购自美国BD?PharMingen公司。细胞内细胞因子专用试剂盒（IntraPrepTM Permeabilization Reagent）购自美国Coulter?Immunotech公司。PMA和伊能霉素（ionomycin）；莫能霉素（ monensin）均为美国Sigma公司产品。RPMI 1640培养液为美国Gibco公司产品；新生牛血清为美国HyClone公司产品。

    细胞培养与染色

    取200  μl抗凝血加入10 μl  CD4?Pc5单克隆抗体，室温避光孵育30分钟，用RPMI 1640培养液洗涤1次，将细胞加入RPMI  1640培养体系中（含新生牛血清10%、青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml、PMA 40 ng/ml、 ionomycin 1 μg/ml、 monensin 2 μmol/L）， 37℃、  5%  CO2、孵育18小时。用PBS洗涤1次，用Coulter?Immunotech公司专用细胞内细胞因子试剂（按试剂盒说明书）进行细胞固定、透膜。将细胞分成2管，1管为测定管，同时加入抗人IL?4?PE和IFN?γ?FITC；另1管加入同型对照，室温、避光30分钟，用PBS洗涤1次，待测。

    流式细胞术测定

    打开流式细胞仪及氩激光光源（488 nm）预热20分钟，仪器自动用标准荧光微球初始校正光路和荧光补偿，然后依次检测标本，每份标本检测50 000以上细胞；在前向散射光（FS）和侧向散射光（SSC）散点图中圈定淋巴细胞群，然后分析CD4阳性细胞中IL?4?PE和IFN?γ?FITC的表达。分析软件为EXPOTM32?MultiCOMP。

    统计学处理

    采用STATA机统计处理系统进行分析，所有数据采用中位数（均数±标准差）表示，组间比较采用χ2检验。

    结    果

    造血功能重建

    23例患者异基因移植后性染色体、ABO血型、DNA可变串重复序列检查表明，供者型完全植入，均获得造血功能重建。中性粒细胞恢复到0.5×109/L及血小板恢复到20×109/L的中位时间分别为移植后15（10-23）天及20（10-66）天。

    aGVHD观察

    23例患者中发生aGVHD 共8例，其中3例Ⅰ度aGVHD， 2例Ⅱ度aGVHD， 3例Ⅲ度aGVHD，没有Ⅳ度aGVHD，15例未发生aGVHD。移植后aGVHD发生中位时间为29（11-49）天。我们发现，严重的aGVHD发生早，程度较轻的发生较晚； aGVHD患者的临床表现主要有皮疹、肝功能损害、腹泻、腹痛及发热等症状。大部分aGVHD患者经用甲基强的松龙或（和）FK?506等药物后，病情得到良好控制，皮疹、肝功能损害、腹泻等症状明显减轻。

    Th细胞亚群的变化

    无aGVHD组、Ⅰ度aGVHD组和Ⅱ-Ⅳ度aGVHD组患者移植后早期（移植后第7天）的Th细胞亚群比例变化检测显示，Ⅱ-Ⅳ度aGVHD组患者的Ｔh1细胞内IFN?γ表达（29.88±5.18）%，明显高于未发生aGVHD组（15.16±4.22）%（p<0.01）。Ⅱ-Ⅳ度aGVHD组患者的Th2细胞内IL?4表达率（0.44±0.12）%，明显低于未发生aGVHD组（3.10±0.82）%（p<0.05）（附表）。动态观察发生aGVHD的患者移植前后Ｔh细胞比例变化时，我们发现aGVHD患者， 在aGVHD发生前7日内未用治疗药物时的Ｔh1细胞量明显高于移植前，经治疗病情稳定后Ｔh1细胞比例明显下降；而未发生aGVHD的患者，移植前后Ｔh1细胞比例变化不大。附图以1位发生Ⅲ度aGVHD(移植后32天)的allo?HSCT患者为例，显示该患者Ｔh细胞的检测结果。

    讨    论

    国外新近研究认为由CD4+Th1细胞分泌产生的细胞因子如IL?2对aGVHD有促进作用，由CD4+Th2细胞分泌产生的细胞因子如IL?10，通过阻止IFN?γ的分泌，对细胞免疫应答起抑制作用［2］；由IL?2刺激供者淋巴细胞产生大量细胞因子如IL?1、TNF?α、IFN?γ、IL?6等引发细胞因子瀑布式效应，导致靶器官的各种病理损伤［3］。

    从目前发表资料的来看，Th1细胞主要产生IL?2、TNF?α、IFN?γ（Th1细胞因子），Th2细胞主要产生IL?4、IL?5、IL?6、IL?10及IL?13（Th2细胞因子），其中IL?4、IL?10和IL?13对Th1细胞因子有重要抑制效应。可以认为，aGVHD的发生与Th1和Th2细胞的失衡有关［4］。

    为了探讨Th1和Th2细胞亚群及其分泌的细胞因子的分泌调节的差异和异常是否是aGVHD发病的主要机制。我们采用流式细胞仪检测技术，从单细胞水平结合多参数分析，对各种经体外刺激的CD4+ T细胞不同淋巴细胞亚群的细胞内因子进行检测和分析,以期阐明CD4+T淋巴细胞中Th1、Th2细胞亚群与aGVHD之间的关系。

    我们采用先标记CD4，然后再进行PMA（PKC蛋白激酶）和 ionomycin（Ca2+载体）刺激培养以CD4+来确定Th细胞。CD4+细胞经刺激培养18小时后IFN?γ、IL?4可得到充分表达。此时可检测各个标本Th1细胞（IFNγ+/IL4- ）、Th2细胞（IFNγ-/IL4+）的比例［5］。

    我们的结果显示，异基因造血干细胞移植患者移植后发生Ⅱ-Ⅳ度aGVHD组的Ｔh1细胞内IFN?γ表达（29.88±5.18）明显高于未发生aGVHD组（15.16±4.22）。发生Ⅱ-Ⅳ度aGVHD组的Th2细胞内IL?4表达（0.44±0.12）明显低于未发生aGVHD组（3.10±0.82）（p<0.05）。由于主要分泌IFN?γ的Th1和主要分泌IL?4的Th2亚群两者是相互抑制、相互调节的，因此可以认为aGVHD的发生与Th1和Th2细胞的失衡有关。我们的研究还证实了Ｔh1细胞（IFNγ+/IL4- ）在临床aGVHD的发病中起重要的致病作用，而移植早期动态监测Th细胞亚群中Ｔh1细胞的比例有助于早期预测移植后aGVHD的严重程度。

【】
  1Slavin S, Nagler A, Naparstek E, et al. Nonmyeloablative stem cell transplantation and cell therapy as an alternative to conventional bone marrow transplantation with lethal cytoreduction for the treatment of malignant and nonmalignant hematologic diseases. Blood, 1998; 91: 756-763

2Grimm J, Zeller W Zander AR, et al. Soluble interleukin?2 recetor serum levers after allogeneic bone marrow transplantation as a marker for GVHD. Bone Marrow Transplant, 1998;21:29-32

3Holler E, Roncarolo MG, Hintermeler?Knabe R, et al. Prognostic significance of increased IL?10 production in patients prior to allogeneic bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant, 2000;25:237-241

4Ferrara JL, Krenger W. Graft?versus?host disease: the influence of type 1 and type 2 T cell cytokines. Transfus Med Rev, 1998; 12:1-7

5Murphy WJ,Welniak LA,Taub DD, et al. Differential effects of the absence of interferon?gamma and IL?4 in acute graft?versus?host disease after allogeneic bone marrow transplantation in mice.J Clin Invest, 1998;102:1742-1748??