急性髓系白血病M1的免疫学特征和预后分析
【摘要】 本研究探讨急性髓系细胞白血病M1(AML M1)免疫学特征及其预后，同时探讨其与AML M2以及急性淋巴细胞白血病(ALL)免疫学鉴别的要点。采用CD45/SSC双参数散点图设门，应用三色流式细胞术对47例M1的初诊患者骨髓标本进行免疫分型，并对其中17例进行核型分析；另外，选择同期51例 M2的初诊患者及58例ALL初诊患者作为对照。结果表明： M1患者的CD33阳性率达到100%，且灵敏度高，但特异性低；M1患者的CD11b、CD15、MPO、CD117的阳性率均显著低于M2患者(p<0.05)；Ly+AML的 M1患者的T系抗原阳性率高于Ly+AML M2患者(p<0.05)；与ALL Pro?B相比，AML M1患者高表达HLA?DR，髓系抗原CD13、CD15、CD33、CD117、MPO，T系抗原CD4、CD7均显著高表达(p<0.05)；与ALL Pre?B相比，M1患者高表达HLA?DR、CD34；髓系抗原CD13、CD15、CD33、CD117、MPO，T系抗原CD4、CD5均显著高表达(p<0.05)；与T?ALL相比，M1患者早期抗原HLA?DR、CD34,髓系抗原CD13、CD15、CD33、CD117、MPO均显著高表达(p<0.05)；M1患者中CD7+患者CR率和CD7-患者CR率之间没有统计学差异(p>0.05)，CD34+患者CR率和CD34-患者CR率之间没有统计学差异(p>0.05)，M1患者CR率低于M2患者（p<0.05）,其达到CR的时间长，高白细胞白血病的发生率高(p<0.05)，高白细胞白血病的CR率低(p<0.05)。结论： M1患者的髓系抗原CD33、CD13均高表达，早期抗原 HLA?DR也高表达，但髓系抗原CD11b、CD15、MPO、CD117表达不高，T系抗原CD4、CD7高表达；M1和M2免疫学方面没有明确的、特征性的标志可用来鉴别，但M1患者的CD11b、CD15、MPO、CD117的阳性率均显著低于M2患者，在鉴别M1与M2时可作为指标之一；形态学上不易分辨的AML M1 和ALLPro?B，ALLPre?B，T?ALL可以通过免疫学特征的分析得到鉴别；CD117主要表达于AML，对于AML和ALL的鉴别诊断有意义；M1患者的预后比M2患者差。
【关键词】 急性 髓系白血病
Immunologic Characteristics and Prognosis of Acute Myeloid Leukemia M1
Abstract The study was aimed to investigate the immunological characteristics and prognosis of acute myeloid leukemia (AML) M1 and to find the main points in immunology to differentiate AML M1 from M2, and M1 from ALL(proB, preB, T). Immunophenotyping was performed in 41 AML M1 patients by three?color flow cytometry analysis using CD45/SSC gating, meanwhile the cytogenetic analysis was performed in 17 patients. 51 newly diagnosed AML M2 patients and 58 newly diagnosed ALL patients were used as control at the same time. The results showed that the positive rate of CD33 in M1 was 100%, which was high in sensitivity, but low in specificity; the positive rate of CD11b, CD15, MPO, CD117 in M1 were significantly lower than that in M2 (p<0.05); the positive rate of T?lineage antigen in Ly+AML M1 was higher than that in M2 (p<0.05); compared with ALL ProB, M1 had high expression of HLA?DR, simultaneously myeloid antigen CD13， CD15， CD33， CD117， MPO and T?lineage antigen CD4, CD7 were all highly expressed (p<0.05); compared with ALL PreB, M1 had high expression of HLA?DR, CD34, meanwhile myeloid antigen CD13， CD15， CD33， CD117， MPO and T?lineage antigen CD4, CD5 were all highly expressed (p<0.05); as compared with T?ALL, the early?phase antigen HLA?DR, CD34, myeloid antigen CD13, CD15, CD33, CD117, MPO of M1 were all significantly highly expressed (p<0.05). In M1, the complete remission(CR) rate in patients with CD7 positive had no statistical difference from that in patients with CD7 negative (p>0.05); the CR rate of patients with CD34 positive had no statistical difference from that of patients with CD34 negative (p>0.05); CR rate in M1 was lower than that in M2 (p<0.05), time to reach CR was longer, the incidence of hyperleukocytic acute leukemia was higher (p<0.05), CR rate in hyperleukocytic acute leukemia was lower (p<0.05). It is concluded that the myeloid antigen CD33, CD13 in M1 are highly expressed, early?phase antigen HLA?DR in M1 is also highly expressed, but the myeloid antigen CD11b, CD15, MPO, CD117 in M1 are lowly expressed, T?lineage antigen CD4,CD7 in M1 are highly expressed in the meantime. There is no definite characteristic marker in immunology to differentiate M1 from M2, but as the positive rate of CD11b, CD15, MPO, CD117 in M1 are significantly lower than that of M2, CD11b, CD15, MPO, CD117 can be used as reference indicators to differentiate M1 from M2. AML M1, ALL ProB, ALL PreB and T?ALL, which are difficult to differentiate in morphology can be well seperated through the analysis of immunological phenotype. CD117 is mainly expressed in AML, which is useful for the differentiation diagnosis between AML and ALL. The prognosis of M1 is worse than that of M2.
Key words acute myeloid leukemia； AML M1； AML M2；ALL； immunologic characteristics
实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(4)急性髓系白血病M1的免疫学特征和预后分析 急性髓系白血病(AML)是一种不成熟髓系细胞恶性增殖、集聚于骨髓及外周血为特点的肿瘤性疾病，疾病表现出较大的异质性。但其诊断依照于FAB形态学标准，有时难以与AML M2和部分ALL鉴别。为探讨AML M1的免疫分型特点及其与预后的关系，我们进行了回顾性研究，现报道如下。
材料和方法
研究对象
1997年1月至2006年4月在我院就诊的AML M1患者47例，其中男性25例，女性22例，平均年龄40.87岁；兼备淋系，髓系表达的AML有15例。同期在我院就诊的AML M2患者51例，其中男性32例，女性19例，平均年龄33.92岁；兼备淋系，髓系表达的AML有13例。同期ALL患者58例，其中男性37例，女性21例，平均年龄18.24岁；B细胞系列的ALL(B?ALL)48例，T细胞系列的ALL(T?ALL)10例。
免疫分型检测
取肝素抗凝的骨髓液3-5 ml，经淋巴细胞分离液分离获取单个核细胞，采用直接免疫荧光技术三标记法分析，以CD45/SSC双参数散点图设门，每测定管收集10 000个细胞，测定结果采用CellQuest软件进行分析。本研究采用FACS Calibur流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司生产)，以FITC、PE、PERCP作为荧光剂(均为Becton Dickinson公司生产)标记抗体。单克隆抗体的选择包括髓系相关的CD13，CD33，CD14、CD15、CD117、CD11b，T系相关的CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8；B系相关的CD19、CD20、CD22、CyCD79a；系列非相关性CD10、CD34、CD38、TdT、HLA?DR。结果判断：CD45/SSC 设门中白血病细胞群表面抗原阳性率≥20%为阳性，MPO≥10%为阳性。
化疗方案
M1组以DA(柔红霉素、阿糖胞苷)为主要诱导方案(共22例)，其他方案有IA(去甲氧柔红霉素、阿糖胞苷)，MA(米托蒽醌、阿糖胞苷)，DA+VP16，MEA(米托蒽醌、阿糖胞苷、VP?16)，CAG(阿克拉霉素、阿糖胞苷、G?CSF)，VP?16+阿糖胞苷，中剂量阿糖胞苷。M2组以DA为主要诱导方案(共20例)，方案同M1。ALL组以DVLP(柔红霉素、长春新碱、左旋门冬酰胺酶、泼尼松)为主要诱导方案，其他方案有DVP，DVCP(DVP方案＋环磷酰胺)，DVLCP(DVCP+L-门冬酰胺酶)。两组均于2个疗程结束后评价骨髓缓解情况。
诊断标准
所有病例均根据临床表现、细胞形态学、免疫组织化学、免疫表型等多项指标综合诊断；部分病例为进行性杂合性白血病(HAL)，其免疫表型的诊断根据白血病免疫学特征欧洲协作组(EGIL)［1］推荐的积分标准进行判断，对于免疫分型诊断为AML又同时存在淋系抗原表达阳性，但又不够急性混合细胞白血病诊断标准的，视为伴淋系抗原表达的AML(Ly+AML)。WBC>100×106视为高白细胞白血病。疗效判断依据1987年苏州会议标准［2］。
统计学分析
样本率的比较采用χ2检验。
结 果
AML M1免疫表型见附表
AML M1中，CD33具有高度灵敏性，在AML M1中阳性率为100%，其次为CD13和HLA?DR，分别为87.2%和83%。MPO阳性率为53.2%，CD117为55.3%，CD34为44.7%，CD15为34.0%，CD11b为19.2%。T系抗原中，CD4阳性率最高，为31.9%，其次为CD7，阳性率为27.7%；B系抗原中，CD19阳性率2.1%，CD22阳性率2.1%。
M1免疫表型与M2的比较
M1的情况如前所述，M2中CD33阳性率最高，为94.1%；其次为CD13，阳性率92.2%；MPO阳性率为84.3%，CD15阳性率为80.4%，HLA?DR阳性率为74.5%，CD11b阳性率为54.9%，CD34阳性率为52.9%，CD38阳性率为78.4%。T系抗原中CD4阳性率为58.8%，CD7阳性率为7.84%；B系抗原中CD19阳性率为5.9%，CD22阳性率为2.0%。M1患者CD11b，CD15，MPO，CD117的阳性率均显著低于M2患者(p<0.05)，CD4和CD7的阳性率显著高于M2患者(p<0.05)。
Ly+AML中的 M1与M2的比较
M1中15例伴淋系抗原表达，淋系抗原表达阳性率36.6%,其中14例为T、髓系表达，1例为B、髓系表达。髓系抗原中CD33阳性率为100%，CD13为73.3%，CD15为46.7%，MPO为53.3%，CD11b为26.7%；早期抗原中HLA?DR阳性率为93.3%，CD34为53.3% ，CD117为53.3%； T系抗原中CD7阳性率为86.7%，CD2为33.3%，CD4为20%。Ly+AML M1 和Ly?AML M1在前血象及CR率无明显差别(p>0.05)。
M2中13例伴淋系抗原表达，淋系抗原表达阳性率25.5%，其中7例为T、髓系表达，4例为B、髓系表达，2例为髓淋系表达。髓系抗原中CD33阳性率为100%，CD13为92.3%，CD11b为69.2%，MPO为92.3%，CD15为69.2%；早期抗原中HLA?DR阳性率为76.9%，CD34为69.2% ，CD117为92.3%；T系抗原中CD4阳性率最高，为69.2%，CD2为30.8%，CD7为30.8%。
Ly+AML中M1淋系抗原阳性率高于M2，但没有显著性差异(p>0.05)；进一步检测，M1T系抗原阳性率显著高于M2(p<0.05)。髓系抗原中MPO、CD11b、CD117 M1的阳性率均显著低于M2(p<0.05)。
Figure 1. Immunophenotyping result of AML by three?color flow cytometry. R1: blast cells; R2: lymphocytes; R3: mononuclear cells; R4: granulocytes; R5: erythrocytes.
M1和ALL ProB免疫表型的比较
M1 CD45/SSC散点图如图1。与ALL Pro?B相比较，AML M1高表达HLA?DR(83%) ，CD117(55.3%)；髓系抗原CD13(87.2%)，CD15(34.0%,)，CD33(100%)， MPO(53.2%)，T系抗原CD4(31.9%), CD7(27.7%)均为显著高表达(p<0.05);ALL Pro?B CD34阳性率100%，B系抗原CD19(100%)，CD20(66.7%)，CD22(41.7%)，CD79a(16.7%)均为显著高表达(p<0.05)。
M1 和ALL PreB免疫表型的比较
与ALL Pre?B相比，AML M1高表达HLA?DR(83%)，CD34(44.7%)，CD117(55.3%)；髓系抗原CD13(87.2%)，CD15(34.0%)，CD33(100%)，MPO(53.2%)，T系抗原CD4(31.9%)，CD5(21.4%)均显著高表达(p<0.05)；ALL Pre?B B系抗原CD19(100%)，CD20(71.4%)，CD22(57.1%)，CD79a(50%)及CD10(57.1%)均显著高表达(p<0.05)。ALL Pre?B CD45/SSC 散点图见图2。
Figure 2. Immunophenotyping result of ALL by three?color flow cytometry. R1: blast cells; R2: lymphocytes; R3: mononuclear cells; R4: granulocytes; R5: erythrocytes.
M1和 T?ALL免疫表型的比较
与T?ALL相比，AML M1早期抗原HLA?DR(83%),CD34(44.7%), CD117(55.3%),髓系抗原CD13(87.2%)，CD15(34.0%)，CD33(100%)，MPO(53.2%)均显著高表达(p<0.05)；T?ALL T系抗原CD2(60%)，CD3(70%)，CD4(70%)，CD5(90%)，CD7(90%)，CD8(60%)及CD10(50%)的表达均显著高于AML M1(p<0.05)。
M1免疫学表型与预后关系及与M2的比较
M1患者的CR率为33.3%，达CR平均时间为34.83天。CD7+患者CR率为33.3%，CD7-患者为36.4%，两者没有显著性差异(p>0.05)。CD34+患者CR率为33.3%，CD34-为36.4%，两者没有显著性差异(p>0.05)。47例AML M1患者中，高白细胞计数的患者9例，占19.1%，无1例达CR。
M2患者的CR率为60.9%，达CR平均时间为24.1天。51例AML M2患者中，高白细胞计数的患者2例，占3.9%，1例获CR。
M1患者的CR率低于M2患者(p<0.05)，达CR平均时间比M2长。高白细胞白血病阳性率高于M2(p<0.05)，M1患者的CR率低于M2患者(p<0.05)。
讨 论
在WHO髓系肿瘤分类新方案中，对AML的分类仍沿用FAB标准，即细胞形态学辅以细胞化学染色来确定AML的亚型。AML M1即急性粒细胞白血病未成熟型，骨髓中原始粒细胞≥90%(NEC),早幼粒细胞很少，中幼粒细胞以下阶段不见或罕见［2］。由于FAB分型中， M1 和M2是以细胞成熟程度来划分的，单纯形态学分型有一定的局限性，而骨髓中以原始细胞为主使得M1和ALL，特别是免疫学分型中的ALL Pro?B, ALL Pre?B以及T?ALL在细胞形态学的鉴别上也存在一定困难，这就需要通过免疫学表型来加以鉴别。
细胞免疫分型是诊断血液恶性肿瘤不可缺少的重要指标之一。应用白细胞表面抗原高度特异的单克隆抗体、测定白细胞膜表面标记和免疫球蛋白重组以及T 细胞受体基因技术,可精确测试白血病细胞源性、分化阶段及克隆特征,有助于临床分型、预后判断和指导治疗。流式细胞术由于能快速、多参数、客观地定性或定量测定单个细胞膜上的多种抗原表达或同时测定膜、浆与核的抗原,已逐渐成为白血病和淋巴瘤免疫分型的主要工具。CD45 表达于所有的白细胞膜,其表达强度与细胞种类有关：成熟粒细胞> 单核细胞> 淋巴细胞> 原始/幼稚细胞,红细胞和浆细胞不表达CD45。SSC与细胞大小成正相关,以CD45/ SSC 双参数散点图设门方法将骨髓细胞分成淋巴细胞、单核细胞、成熟粒细胞、幼稚细胞和有核红细胞群,这样可排除正常细胞对免疫分型的干扰,提高白血病免疫分型的特异性和敏感性。本研究以CD45/ SSC 双参数散点图设门,即使在幼稚细胞比例较低或用外周血进行检测的情况下,仍可清楚地区别白血病细胞和正常细胞,结果准确可靠。
M1的髓系抗原CD33、CD13均高表达，早期抗原 HLA?DR也高表达，但髓系抗原CD11b、CD15、MPO、 CD117表达均明显低于M2，T系抗原CD4、CD7高表达。在M1中CD33具有高度灵敏性，阳性率为100%，高于姚志娟等［3］报道，但特异性较差，与M2没有显著性差异。HLA?DR阳性率为83%，高于M2，CD13阳性率为87.2%，低于M2，但都没有显著性差异。髓系抗原CD11b、CD15、MPO在M1的阳性率均显著低于M2，这些都表明M1细胞成熟程度低于M2。
M1的CD117 阳性率为 55.3%，M2为76.5%，均显著高于ALL ProB，ALL PreB和T?ALL，我们和其他学者都认为CD117主要表达于AML，对AML和ALL的鉴别诊断有帮助［4］。对CD117在髓系的表达各家有不同的看法，Bene等［5］认为，CD117在AML各亚型之间表达无明显差别；Di Noto等［6］认为，CD117的表达主要集中于分化比较早期髓细胞系或亚型(M1、M2)；M2阳性率高于M1［7］。本研究中M1、M2的CD117阳性率均较高，并且M2阳性率显著高于M1。但ALL的CD117阳性率为10.4%,高于文献报道［5］，这可能与①髓系抗原阳性表达的判断标准不一致；②病例数多少不一，统计学结果有偏差；③所用仪器设备和单抗的种类及其灵敏度的不同有关。
M1中CD7的阳性率为27.7%，显著高于M2，和Drexler等［8］报道M1的CD7阳性率高于M2一致。文献报道CD7+对CR率的影响不一［9，10］，本研究中M1 CD7+患者CR率为33.3%，CD7-患者为36.4%，两者没有显著性差异;CD34+患者CR率为33.3%，CD34-患者为36.4%，两者也没有显著性差异。所以我们认为，CD7，CD34对M1的CR率没有影响。
M1中T系抗原阳性率为29.8%，高于M2，亦高于Anne等的报道［11］。 Ly+AML M1中T系抗原表达率为93.3%，高于Ly+AML M2。Ly+AML M1 和Ly-AML M1在治疗前血象及CR率无明显差别。
M1与ALL ProB相比，高表达HLA?DR，髓系抗原CD13、CD15、CD33、CD117、MPO，T系抗原CD4、CD7均显著高表达；ALL Pro?B的CD34阳性率100%，B系抗原CD19、CD20、CD22、CD79a均显著高表达。与ALL Pre?B相比， M1高表达HLA?DR，CD34；髓系抗原CD13、CD15、CD33、CD117、MPO，T系抗原CD4、CD5均显著高表达；ALL Pre?B B系抗原CD19、CD20、CD22、CD79a均显著高表达。与T?ALL相比，AML M1早期抗原HLA?DR、CD34，髓系抗原CD13、CD15、CD33、CD117、MPO均显著高表达；T?ALL的T系抗原CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10的表达均显著高于M1。
从上述可以看出， M1和M2免疫学上没有一个很明确的，特征性的标志可用来鉴别， M1髓系抗原CD11b、CD15、MPO、CD117的阳性率均显著低于M2，这和其分化成熟程度低于M2一致，可作为鉴别M1与M2时的参照指标之一。而形态学上不易分辨的AML M1 和ALL Pro?B、ALL Pre?B、T?ALL可以通过细胞的免疫学特征达到很好的鉴别。
AML M1的CR率低于AML M2;达CR平均时间比AML M2长，高白细胞计数M1 10例， 其CR率低于M2(p<0.05)。综上所述，我们认为M1预后要比M2差。
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