非甾体消炎药对结肠癌细胞HT-29中 瘦素作用的初步研究
【关键词】 非甾体消炎药
非甾体消炎药（NSAIDs）是一类以抗炎为主，兼有解热、镇痛作用的药物。近20年来，动物实验、临床研究、个案报道和流行病学资料均显示NSAIDs药物对腺瘤性息肉有作用，并可以预防结肠癌的发生，但其机制尚未完全阐明。目前研究发现瘦素（Leptin）作为一种具有促生长作用的激素，在许多恶性肿瘤中都存在表达，推测其在刺激恶性肿瘤细胞的增殖、调节肿瘤血管的生成及肿瘤侵袭、转移等方面起重要作用。本实验则旨在观察NSAIDs药物对HT-29结肠癌细胞中瘦素的作用，在理论上初步阐明其抗结肠肿瘤的可能机制。
1材料和方法
1.1材料人类结肠癌细胞株HT-29购自湘雅医学院肿瘤研究所，Leptin、表皮生长因子（EGF）、阿斯匹林购自Sigma公司，NS-398购自Cayman公司，其他如RPMI1640培养基、0.5%MTT溶液、D-Hank′s液、0.25%胰蛋白酶、碘化丙啶、青霉素G、链霉素、0.5MPBS等试剂由武汉大学医学院消化及肝病研究所配备。主要仪器有恒温二氧化碳培养箱、XDS-1型倒置显微镜、自动移液器、Digiscan SA1000A型酶联免疫检测仪、YJ- 875S超净工作台、Beckman离心机（JM-6）、1808自动双重纯水蒸馏器等。
1.2 方法
1.2.1细胞培养 人类结肠癌细胞株HT-29常规培养于含有10%小牛血清、50IU/ml青霉素和50mg/ml链霉素的RP-MI1640培养液中，在37℃、5%CO2 培养箱中贴壁培养，每3天用0.25%胰蛋白酶消化传代一次。正常生长状态下的HT-29细胞为上皮样，单层贴壁生长。每次实验时使用苔盼蓝染色，活细胞记数大于98%。
1.2.2细胞记数法检测NSAIDs药物对瘦素促进细胞生长的影响 取亚融合状态的HT-29细胞，0.25%胰蛋白酶消化后在显微镜下观察，制成单细胞悬液。用吸管轻轻吹打细胞悬液后，在血球记数板上加微量细胞悬液，加样量不要溢出玻片，也不要过少或带气泡，以覆盖血球记数板四角大方格为宜。记数:显微镜下，用10×物镜观察记数板四角大方格中的细胞悬液，细胞压线时，只计左侧和上方者，不记右侧和下方者。细胞密度:细胞密度=细胞数/毫升原液=（4大格细胞数之和/4）×104 ，连续记数3次，调整至平均值为4.4×104 ;取182μl细胞原液，补加818μl培养液即成8×104 个细胞。实验共分5组:①空白对照组;②溶煤对照组;③瘦素组（200 ng/ml）;④NS-398（10μM）+瘦素（200 ng/ml）;⑤阿斯匹林（2mM）+瘦素（200 ng/ml）。以上每组均置于37℃、5%CO2 培养箱中培养72h。药物干预后，每天每组取3孔测细胞数。记数前，用冷PBS轻轻震荡，以便去除死细胞。记数方法同前，计算其平均值。以培养时间为横轴，细胞数为纵轴绘制生长曲线。
1.2.3细胞增殖的检测采用MTT比色法 取对数生长期的HT-29细胞按传代方式制成单细胞悬液，细胞密度为5×104 /ml。将上述细胞悬液接种于96孔培养板，每孔加细胞悬液200μl（相当于1×104 个细胞），另取一孔加入不含细胞的培养液作为空白调零。将培养板置在37℃、5%CO2 培养箱中贴壁培养24h后，设实验组①和②以及对照组。培养24h后，实验组①加入浓度分别为5ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200 ng/ml的瘦素后，再加入浓度为2mM阿斯匹林;实验组②加入浓度分别为5ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200 ng/ml的瘦素后，再加入浓度为120μmol/L NS-398;对照组则为不加NSAIDs药 物的以上浓度瘦素组，每组3复孔。此后每天更换培养基及加药使其保持药物浓度，在培养板每孔加入0.5%MTT液20μl，在培养4h后，小心吸除孔内液体，每孔加入二甲基亚砜200μl，震荡10min后，用自动酶标仪于492nm波长下测定各孔的吸光度值（OD值）。
2统计学处理
采用统计软件SPSS10.0分析。根据资料性质，实验数据以均数±标准差表示，用随机区组设计资料的方差分析， P <0.05认为差异有显著性。
3结果
3.1细胞记数细胞接种后，空白组及溶煤组细胞生长正常，瘦素组（200ng/ml）细胞数目明显增加，而阿斯匹林和NS-398干预的瘦素组细胞数目明显减少，低于空白组及溶煤组，且随时间的延长而下降。见图1。
图1 生长曲线观察不同实验组对细胞增殖的影响（略）
2.2MTT检测为进一步确定NSAIDs药物干预瘦素促HT-29细胞生长的作用，本实验同时采用MTT法检测细胞生长情况，结果发现，阿斯匹林和NS-398干预的瘦素组较单纯瘦素组比较，HT-29细胞的生长出现抑制现象，在72h内呈时间依赖性。结果见表1～3。
表1 MTT法观察瘦素对HT-29细胞生长的影响（略）
注:不同浓度组之间OD值比较: F=256.034，P<0.05，
其中两两比较:P <0.05;不同天数之间OD值比较:F=49.858， P<0.05，其中两两比较，P <0.05。
表2 MTT法观察阿斯匹林干预瘦素 对HT-29细胞生长的影响 （略）
注:不同浓度组OD值比较: F=205.771，P<0.05，两两间比较，P <0.05;不同天数间OD值比较: F=58.522，P< 0.05， 两两间比较，P <0.05。
表3 MTT法观察NS-398干预瘦素对HT-29细胞生长的影响（略）
注:不同浓度组OD值比较: F=102.238，P<0.05，两两比较，P <0.05;不同天数间OD值比较: F=73.492，P< 0.05， 两两间比较，P <0.05。
4讨论
NSAIDs药物抗肿瘤的机制尚未完全明了，目前的一般共识是其通过抑制COX（特别是COX-2），使PGE2 含量下降，白三烯水平升高所致。具体为:①促进机体正常细胞的免疫监视功能，加强其杀伤肿瘤细胞能力;②促进机体抗肿瘤抗体生成;③诱导肿瘤细胞加快凋亡;④对某些肿瘤启动基因（如H-ras，K-ras）以及蛋白激酶（A、C）起抑制作用;⑤改变肿瘤细胞内的信号传递，从而阻断肿瘤细胞的增殖周期。此外，通过角膜微囊测定的方式，发现选择性COX-2抑制剂celecoxib可以抑制成纤维生长因子所诱导的血管生成［1］。正常结肠黏膜中的花生四烯酸（AA）代谢主要经脂氧化途径形成白三烯，后者被认为是结肠黏膜的保护因子。而在结肠肿瘤组织中，IL-1、TNF、EGF、iNOS等诸多细胞因子通过有丝分裂原激活COX-2，使PGE2 的生成增加。PGE2 是重要的免疫调节因子，对免疫反应有多方面的影响，并和剂量相关。浓度高的PGE2 （156 ～157 M）可提高细胞内的cAMP水平，cAMP浓度增加就抑制了机体的免疫能力:巨噬细胞、肿瘤杀伤细胞数目减少;IL-1、IL-2等细胞因子减少;抗体的产生减少。这样，就有利于肿瘤细胞逃避免疫监视，生长迅速。与之相反的是，浓度低的PGE2 （18-9～10-8M）则可提高细胞内cGMP的水平，加强机体免疫应答的能力，不利于肿瘤细胞的生长。瘦素是一种具有多种功能的细胞因子，参入了机体神经、免疫、内分泌的调节作用。此外，作为一种上皮细胞和血管内皮细胞的促生长因子，瘦素还具有促细胞增殖分化、增加细胞侵袭性及调节机体免疫的功能，因以上功能是恶性肿瘤得已生长的必备条件，故瘦素亦可能在肝癌［2］、胃癌［3］、结肠癌［4］等消化道恶性肿瘤的发生、中起某些重要作用。实验已发现瘦素可明显上调COX-2和PGE2 的水平，进而促进结肠癌细胞HT-29的异常生长，提示瘦素确具有促结肠癌细胞HT-29细胞增殖分化的能力［5］。 本部分实验研究发现在最显著促结肠癌细胞HT-29生长的瘦素浓度（200ng/ml）中，分别加入浓度为2Mm的阿斯匹林和浓度为120μmol/L的NS-398进行干预，和不加阿斯匹林、NS-398的瘦素组比较，生长曲线、MTT法均显示HT-29细胞的生长受到明显的抑制（ P <0.05），和空白对照组和溶煤对照组比较，两种检测方法亦表明HT-29细胞的生长受到显著性的抑制（ P <0.05）。但阿斯匹林和NS-398两组间比较，其对HT-29细胞的抑制率无显著性差异（ P >0.05）。提示NSAIDs药物阿斯匹林和NS-398都能明显干预瘦素促结肠癌细胞生长的作用，其可能的机制与COX-2相关，而与COX-1无关。现已知道，瘦素发挥其促进肿瘤细胞生长、增殖的生物学效应是通过瘦素受体完成的，具体方式为瘦素和特异性受体结合后，激活信号通路完成的。目前已知的主要信号传递通路为JAK-STAT（酪氨酸激酶-转化因子）通路和P42/44MPAK（有丝分裂原激活的蛋白激酶），其中，前者为主要信号通路，瘦素发挥其生物学效应多依赖它完成［6］，但有实验研究表明瘦素对结肠癌细胞株HT-29的增殖生长和P42/44MPAK通路密切相关［7］，推测NSAIDs药物干预瘦素对HT-29细胞株生长的效应可能和阻断瘦素信号通路有关，这也可能是NSAIDs药物抗结肠肿瘤的机制之一。
【】
1 Leahy KM， Ornberg RL， Wang Y et al.Cyclooxygenase-2 inhibi-tion by celecoxib reduces proliferation and induces apoptosis in an-giogenic endothelial cells in vivo. Cancer Res， 2002，62:625.
2 沈磊，周晶，雷伟，等. 瘦素及其受体与原发性肝癌关系的初步研究. 中华肝脏病杂志，2006，14:10.
3 赵亮，沈志祥，沈磊，等.胃腺癌组织瘦素、瘦素受体表达及其临床意义. 武汉大学学报（医学版），2006，27:36.
4 孙军，沈磊，罗和生，等.结肠癌瘦素和瘦素受体表达及其意义. 中华消化杂志，2006，26:561.
5 王晓玲，沈志祥，沈磊，等. 瘦素对5-氟尿嘧啶损伤结肠癌细胞的影响. 药通报，2006，22:492.
6 Attoub S， Noe V， Pirola L， et al . Leptin promotes invasiveness of kidney and colonic epithelial cells via phosphoinositide 3-kinase-， rho-， and rac-dependent signaling pathways. FASEB J， 2000，14:2329.
7 贾丽苹， 郑元义 . 瘦素和肝纤维化 . 国外医学内分册， 2004，31:104.
