整合素β1和层粘连蛋白在不孕症患者子宫内膜和正常早孕蜕膜组织中表达的研究
【摘要】 目的： 检测整合素β1（Integrin β1）和层粘连蛋白（Laminin，LN）在不明原因不孕妇女子宫内膜、正常子宫内膜和宫内早孕蜕膜组织中的表达情况。 方法： 采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白?过氧化物酶连接法（S?P）法检测30例不明原因不孕症子宫内膜组织，20例宫内早孕蜕膜组织及20例正常宫内膜组织中整合素β1和LN的表达水平及分布。 结果： 整合素β1和LN在宫内早孕蜕膜腺上皮细胞中表达水平增高；整合素β1在不明原因不孕子宫内膜各期腺上皮、基质细胞表达水平显著减低， LN在不明原因不孕子宫内膜表达程度最高。 结论： 整合素β1和LN在子宫内膜的表达异常可使子宫内膜容受性降低、子宫内膜与胚泡发育不同步，从而使着床失败，导致不孕。
【关键词】 整合素β1；层粘连蛋白；子宫内膜；不明原因不孕
Study on the Expression of Integrinβ1 and Laminin in Human Endometrium of Infertility and Normal Early Pregnant Deciduas Abstract
Abstract Objective： To study the expression of Integrinβ1 and Laminin(LN) in endometrium with primary unexplained infertility、normal endometrium and early pregnant deciduas. Methods： The level of expression of Integrinβ1 and LN in 30 unexplained infertility、20 early pregnant deciduas and 20 normal endometrium was measured by immuno?histochemical method(S?P technique). Results： The expressions of Integrinβ1 and LN in normal early pregnant deciduas were both higher than those in the normal endometrium. The expression of Integrinβ1 in infertility was lower during proliferative and secretary phase than those in the forgoing groups. The expression of LN was the highest in the three groups. Conclusion： The abnormal expression of Integrinβ1 and LN will reduce endometrium’s acceptability in infertility, cause the failure of imbed and it can bring about infertility.
Key words integrinβ1; laminin; endometrium; unexplained infertility
不孕症是妇科常见病之一，夫妇经过各项不孕检查未找到确切的不孕原因者，被称为不明原因不孕症，约占不孕症的10%～20%。随着围着床期各种调节因素研究的不断深入，发现子宫内膜局部调节失衡，导致子宫内膜容受性下降可能是不明原因不孕症的病因之一。整合素和LN几乎参与了胚胎植入的全过程，过量、不足或表达类型异常等均有可能引起不孕，但整合素和层粘连蛋白作用的整个环节尚未完全清楚。本实验采用免疫组化S?P法检测不明原因不孕宫内膜组织和正常宫内膜及早孕蜕膜组织中整合素β1和层粘连蛋白的表达水平及分布，探讨它们与不明原因不孕症及正常妊娠的关系，为临床诊断和不明原因不孕症提供某些实验理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
正常子宫内膜组20例，选自2000年1月～2005年7月期间在郧阳医学院附属人民因子宫肌瘤行子宫切除及同期正常生育妇女在月经周期各阶段诊断性刮宫术获取的内膜组织的病人；宫内早孕蜕膜组织组20例；不明原因不孕子宫内膜组30例。
1.2 主要试剂
鼠抗人整合素β1 （integrinβ1）单克隆抗体（浓缩型）、链霉菌抗生物素蛋白?过氧化酶连结（SP）免疫组化试剂盒、DAB显色剂（水剂）、PBS缓冲液、柠檬酸缓冲液、常规HE染色试剂伊红、苏木素、酒精、二甲苯等。
1.3 方法
石蜡块4um连续切片，贴于多聚赖氨酸处理过的载玻片，固定。
免疫组化染色：①石蜡切片脱蜡和水化，修复；②切片加滴3%过氧化物酶阻断溶液，孵育；③ PBS液冲洗，甩去，切片加滴50μl正常山羊血清，孵育；④甩去多余血清，加滴50μl鼠抗人的integrinβ1单克隆抗、鼠抗人的LN单克隆抗，另一张切片加滴50μl的PBS液作阴性对照；⑤PBS液冲洗，甩去，加滴50μl生物素化山羊抗小鼠血清，孵育；⑥PBS液冲洗，甩去，加滴50μl链亲和素—过氧化物酶溶液，孵育；⑦PBS液冲洗，甩去PBS液，加滴DAB溶液显色，观察显色情况；⑧自来水冲洗，苏木精复染；⑨冲洗，氨水返蓝；⑩酒精脱水→二甲苯透明→中性树胶封固。
1.4 结果判断
在 40×10 的高倍镜视野下，每张切片选择具有代表性的5个阳性视野，选取空白区定标，测定每个视野的光密度，求平均光密度(average optical density, AOD)，AOD值越大表明染色越强。
1.5 统计学处理
数据资料中计量资料用均数±标准差(±s)表示，各组样本均数间比较采用SPSS10.0统计分析软件包进行单因素的方差分析，计数资料率的比较采用四格表Fisher精确概率法检验，以α=0.05为检验水准，P<0.05为差别有显著性意义，P＞0.05为差别无显著性意义。
2 结果
2.1 各组标本中整合素β1的表达
整合素β1正常子宫内膜分泌期表达比增生期强，差异有显著性 (P<0.05)；在不明原因不孕组虽分泌期的表达比增生期强，但经统计学分析两者间无显著性差异(P>0.05)；在宫内早孕蜕膜组织中表达水平最高，与另两组正常相比有显著性差异(P<0.05)；在不明原因不孕子宫内膜表达低，与正常子宫内膜及宫内早孕蜕膜组织相比均有显著性差异(P<0.05)。表1 各组子宫内膜组织中整合素β1的平均光密度测定结果(略)注： △ 与增生期比较，P<0.05； #与正常子宫内膜组分泌期比较，P<0.05； *与两组分泌期比较，P<0.05。
2.2 各组标本中LN的表达
在正常子宫内膜组，LN分布在子宫内膜腺上皮及腔上皮的基底膜，分泌期表达强，与增生期相比有显著性差异(P<0.05)。在不明原因不孕子宫内膜中，LN在增生期和分泌期的表达均比正常子宫内膜强，两者相比差异有显著性(P<0.05)。LN在不明原因不孕子宫内膜表达程度最高，与另两组正常相比有显著性差异(P<0.05)，LN在正常子宫内膜分泌期和宫内早孕蜕膜组织中表达高，与正常子宫内膜增生期相比有显著性差异(P<0.05)。表2 各组子宫内膜组织中LN的平均光密度测定结果 (略)注： △与增生期比较，P<0.05；*与正常子宫内膜组增生期比较，P<0.05； #与正常子宫内膜组分泌期及蜕膜组织比较，P<0.05。
3 讨论
3.1 整合素β1和层粘连蛋白在正常子宫内膜中的表达
Shiokawa等［1］研究发现整合素β1在内膜的表达与卵巢功能变化相一致，其表达在整个月经周期都有变化，于分泌期表达占优势。Amsterdam等［2］发现，LN总量在分泌期，特别在分泌中期子宫内膜表达强度增高的同时在增生早期子宫内膜上表达也增高,增生中、晚期表达减少，与本研究结果一致。在排卵期基底膜中LN表达增加,以后子宫内膜表面上皮基底膜中可见持续性增加。人子宫内膜周期中的分泌期正是胚泡的着床期，排卵后表面上皮基底膜中LN增加提示LN可为胚泡着床提供有利的连接条件。植入后子宫内膜的胚泡为了摄取营养，在侵入子宫内膜上皮细胞及基底膜后将含有丰富营养物质的内膜血管作为植入的又一目标，在子宫内膜血管内皮细胞基底膜上呈阳性表达。
3.2 整合素β1和层粘连蛋白在蜕膜组织中的表达
整合素β1是细胞外基质受体的主要成员，蜕膜组织中整合素β1的高表达，可能参与了细胞周围基膜的形成及子宫内膜细胞外基质的重建，为胚胎植入做准备及维持正常妊娠［3］。Shiokawa［4］等发现，小鼠胚泡能在人蜕膜细胞上粘附，并有滋养层细胞扩展。抗整合素β1单抗能抑制滋养细胞在蜕膜细胞的扩展，但不影响粘附。因而推测，蜕膜上的β1族整合素与胚胎滋养层细胞分泌产生的细胞外基质粘附，参与胚胎细胞外基质的构建，并进一步影响滋养层细胞的发育与分化，从而促进滋养层细胞的浸润、迁移。
随着蜕膜的形成，其周围逐渐聚集LN等物质，说明这些物质与蜕膜细胞的功能密切相关。LN能通过细胞膜上相应的整合素受体将细胞粘着到基质上，使细胞沿其浓度梯度定向迁移，并在迁移中分裂增殖。另有实验证实，胚泡发育早期，滋养层细胞表面就有LN及其整合素受体的表达［5］。蜕膜细胞周围的LN增多，一方面增强蜕膜细胞本身的功能，另一方面，LN还可促使蜕膜细胞分泌胶原酶，降解基质中的胶原纤维，使胚泡滋养层不断向蜕膜中侵入，并在LN等细胞外基质的作用下定向迁移、铺展［6］。
蜕膜组织表达LN与妊娠期激素刺激有关，激素刺激可使蜕膜细胞的形态发生改变，分泌的LN分子的组成也发生变化，形成基膜样物质［7］。LN是细胞粘附的重要因素，可能参与孕早期滋养细胞对子宫内膜的粘附，与胚泡着床密切相关。
3.3 整合素β1和层粘连蛋白在不孕症子宫内膜中的表达
在不孕症子宫内膜腺上皮中，两者的表达无明显相关性，这种异常表达可引起子宫内膜容受性的降低而使胚胎着床失败而导致不孕。
本研究显示在不明原因不孕分泌期子宫内膜中整合素β1表达水平明显减低，可能会影响子宫内膜对胚泡的识别、粘附，导致子宫内膜容受性的降低，使着床失败引起不孕。
本研究显示：LN在不明原因不孕子宫内膜中，增生期和分泌期的表达均比正常子宫内膜强，两者相比差异有显著性。LN 在胚泡植入时起着重要连接作用，可促进细胞分化以及降解成纤维细胞的粘附，而过量的LN则抑制植入细胞的增殖，限制胚泡的植入。分泌期子宫内膜LN表达显著高于正常组同期水平，这种过高表达影响子宫内膜对胚泡的接受性，使胚泡不能穿破内膜血窦，母体血液不能正常流入正在发育中的滋养细胞绒毛间隙，胚泡不能顺利植入子宫内膜，对母体子宫内膜的识别、定位和黏着不利。最终子宫内膜发育延迟，子宫内膜与胚泡发育不同步，从而导致不孕。
植入窗口期，子宫内膜表达整合素的同时，内膜基质细胞蜕膜化，细胞表达层粘连蛋白等细胞外基质。本实验发现：在不明原因不孕子宫内膜分泌期整合素β1表达减低及同期LN表达水平的增强，两者同正常子宫内膜分泌期比较有显著性差异，推测在不明原因不孕患者，由于子宫内膜局部分泌整合素β1不足，导致子宫内膜功能成熟落后，内膜容受性下降，影响绒毛滋养层细胞穿透母体子宫内膜而导致着床失败引起不孕；而过量的LN则可抑制植入细胞的增殖，限制胚泡的植入，分泌期子宫内膜LN表达显著高于正常组同期水平，使子宫内膜发育延迟，子宫内膜与胚泡发育不同步，从而导致不孕。从而推测整合素β1同LN一样共同在调节子宫内膜容受性中的作用，两者周期性的表达可能有利于胚泡植入，使妊娠得以顺利进行。
【】
1 Shiokawa S, Yoshimura Y, Nagamatsu S. et al. Expression of β1 integrins in human endometrial stromal and decidual cells. J Clin Endocrinol Metab, 1996, 81(4):1533～1540.
2 Amsterdam A, Dantes A, Hosokawa K, et al. Steroid regulation during apoptosis of ovarian follicular cells. Steroid ,1998 ,63(5?6):314～318.
3 李真，王智彪，顾美礼，等. 整合素在胚胎着床、生长发育及某些妇产科疾病中的作用.中华妇产科杂志，1999，34（4）：254～256.
4 Shiokawa S, Yoshimura Y, Nagamatsu S, et al. Functions of β1 integrins on human decidual cells during implantation. Biol Repord, 1996, 54:745～752.
5 Terranova VP， et al. Modulation of the metastatic activity of melanoma cells by laminin and fibronectin. Science, 1984， 226:982.
6 武玉玲,李少玲,宋卫华,等.层粘连蛋白(LN)和纤维连接蛋白(FN)在植入期地鼠子宫内膜中的表达-形态学和免疫组织化学研究.组织化学与细胞化学杂志, 2000, 9(3): 335～338.
7 Nardo LG, Bartoloni G, Di Mercurio S, et al. Expression of alpha(v)beta3 and alpha4beta1 integrins throughout the putative window of implantation in a cohort of healthy fertile women. Acta Obstet Gynecol Scand, 2002, 81(8):753～758.
