苦参碱诱导多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226凋亡的实验研究
【摘要】 本研究探讨苦参碱对人骨髓瘤细胞株RPMI8226的作用及其机制。用不同浓度苦参碱处理RPMI8226细胞24、48小时，通过形态学观察、Annexin?V分析、DNA琼脂糖电泳、线粒体膜电位检测观察苦参碱对RPMI8226细胞的促凋亡作用。结果表明： RPMI8226细胞经苦参碱处理后，出现典型的细胞凋亡形态，凋亡早期细胞膜外翻，DNA琼脂糖电泳出现典型的梯状结构，线粒体膜电位崩塌。结论： 苦参碱能有效地诱导骨髓瘤细胞株RPMI8226细胞凋亡，凋亡率与药物剂量和作用时间呈依赖性。
【关键词】 苦参碱 多发性骨髓瘤 RPMI8226细胞株 细胞凋亡
Apoptosis of Multiple Myeloma RPMI8226 Cell Line Induced by Matrine
Abstract This study was aimed to investigate the effect of matrine on multiple myeloma RPMI8226 cell line and its mechanism. The RPMI8226 cells were treated with various concentrations of matrine for 24 and 48 hours; the promoting?apoptosis effect of matrine on RPMI8226 cells was observed by morphology, Annexin?V analysis, DNA agarose gel electrophoresis, mitochondrial transmembrane potential detection, etc. The results indicated that after treatment of RPMI8226 cells with matrine, the typical morphology of cell apoptosis appeared, Annexin?V analysis showed positive, the typical ladder was observed in DNA agarose gel electrophoresis, and the mitochondrial transmembrane potential decreased. It is concluded that the matrine can effectively inhibite the RPM8226 cell growth and reduce cell viability in dose?and time?dependent manner. It is presumed that the matrine induces RPMI8226 cell apoptosis through mitochondrial signaling pathway.
Key words matrine; multiple myeloma; RPMI8226 cell; apoptosis
多发性骨髓瘤(MM)是一种浆细胞克隆性增生的血液系统恶性肿瘤，多发生于老年人。随着社会人口的老龄化，其发病率呈逐渐增高的趋势。几十年来对MM一直采用激素和细胞毒性药物联合，但其仍是一种不可治愈的血液系统肿瘤。由此可见，研发新的治疗方法具有重要的临床价值［1,2］。苦参是传统的中草药,具有抗肿瘤抗炎的作用，苦参碱是其中主要的生物碱。多年来的药理和临床研究发现苦参有抗病毒、抗炎、镇痛解热作用和强心、降压、抗心律失常、抗肿瘤作用，特别是抗瘤作用的发现引起了人们的普遍关注［3］。我们的研究结果证实，一定浓度的苦参碱能够诱导骨髓瘤细胞RPMI8226凋亡。
材料和方法
材料
多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226细胞由本实验室保存。苦参碱由生物制品、药品检定所提供，用RPMI 1640培养液调整浓度为10 mg/ml, 4℃保存。RPMI 1640培养液购自Hyclone公司。Annexin?V凋亡检测试剂盒,Rh123及PI购自晶美生物技术公司。流式细胞分析仪FACS Calibur为Beckman公司产品。
细胞培养
RPMI8226细胞培养于含10％小牛血清的RPMI
1640培养液中，取对数生长期细胞，调整细胞浓度为2×105/ml，加入苦参碱使其终浓度分别为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/ml，于37℃、5% CO2条件下培养24、48小时。对照组除不加苦参碱外其余相同。细胞活存率由台盼蓝拒染法测定，根据处理组存活细胞数与死细胞数的比例进行。生长抑制率及细胞活存率按如下公式计算：
对照组细胞数］×100%
活存率=［活细胞数/(活细胞数+死细胞数)］ ×100%
细胞形态学观察
收集经药物作用后的细胞，涂片晾干，瑞氏染色液染色，油镜下观察典型凋亡细胞。
Annexin V/PI测定
用0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/ml 浓度苦参碱处理骨髓瘤细胞RPMI8226 24、48小时后轻轻收获细胞1×106 个，用冷PBS洗1遍后加入490 μl结合缓冲液，轻轻混匀细胞后加入5 μl Annexin V和5 μl PI， 10分钟后用流式细胞仪检测［4］。
DNA琼脂糖凝胶电泳
样品经1 mg/ml苦参碱作用24、48小时后，对每种样品收集1×106 个细胞，酚－氯仿常规提取DNA，取样加入1.5％琼脂糖凝胶电泳1-2小时，溴乙啶溶液染色后，紫外灯下观察结果并拍照。
线粒体跨膜电位（ΔΨ m）检测
取1×106细胞，用PBS洗1次，加入10 μg/ml Rh123 100 μl，37℃孵育30分钟，用PBS漂洗1次，加入终浓度10 μg/ml PI, 在4℃暗处放置30分钟，用流式细胞仪检测［5］。
统计分析
数据以均数±标准差表示，用Microsoft Excel 2000软件进行t检验。
结 果
苦参碱对RPMI8226细胞增殖抑制和杀伤作用
研究结果表明，苦参碱可以抑制RPMI8226细胞的生长，同时伴有细胞活存率降低。RPMI8226细胞经0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/ml苦参碱处理24小时后生长抑制率的3次均值分别为7.8%、17.8%、42.6%、61.8%和82.7%，48小时时分别为10.7%、20.1%、50.1%、70.2%和90.1%;在0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/ml浓度时24小时活存率分别为99.8%、80.1%、51.2%、34.9%、28.6%、7.8%（图1、2），48小时时分别为98.7%、80.1%、51.2%、34.9%、28.6%、7.8% 。根据48小时活存率下降60%-70%选择作为药物处理的浓度。
细胞形态学改变
收集细胞涂片、晾干，HE染色后光学显微镜下可见细胞胞膜皱缩，染色质凝集、边缘化，胞质起泡，甚至有凋亡小体形成（图3B、C）。而对照组细胞大小均匀，形态正常（图3A）。
苦参碱对RPMI8226细胞凋亡作用
以1 mg/ml苦参碱处理RPMI8226细胞24及48小时后， 3次试验结果凋亡细胞率分别达（21.7±1.4）%和（92.5±2.8）%，明显高于未经苦参碱处理组的（3.49±0.3）%（P<0.05, 图4）。
DNA降解
RPMI8226经1 mg/ml苦参碱作用12、24、48小时后，对提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，结果均出现特征性梯形条带，而对照组缺如（图5）。
线粒体跨膜电位改变
1 mg/ml苦参碱处理RPMI8226细胞24小时，PI阴性及Rh123弱阳性的细胞(早期凋亡细胞)比例开始增高，达到19.7±2.5%，到了48小时后PI阳性及Rh123阳性细胞明显增高达到81.9±3.7%，表明细胞逐渐向继发性坏死阶段演变(图6）。
讨 论
恶性肿瘤（包括白血病和实体瘤）是严重危害人类生命健康的全球性公共卫生问题。对其发病原理、诊断和的研究，一直是生物医学研究领域内的热点问题［6］，而细胞凋亡是多细胞生物消除有害细胞的主要机制，开展促细胞凋亡的抗肿瘤药物研究是目前国际医药领域最前沿的研究方向之一［7］。苦参碱是传统中药苦参的主要生物碱之一，具有抑制肿瘤细胞生长、抗风湿、抗感染、升高白细胞数的功能。最近几年我国学者陆续发现苦参碱具有明确的诱导白血病细胞凋亡作用。如张彦等［8］发现低浓度苦参碱诱导K562细胞分化，而高浓度苦参碱诱导K562细胞凋亡。冯骥良等［9］发现，苦参碱能够抑制JM细胞株增殖并诱导其凋亡，但是苦参碱对骨髓瘤细胞的作用效果至今尚未有报道 。
诱导细胞凋亡有3种信号通路： FAS信号通路、线粒体信号通路和内质网信号通路。目前认为，线粒体途径在凋亡过程中发挥枢纽作用。在细胞凋亡过程中，细胞膜双分子层中的磷脂不平衡分布会被破坏，发生磷脂外酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS）由内层向外层的翻转，暴露在外面的磷脂酰丝氨酸可以被周围的吞噬细胞识别、吞噬，从而使凋亡的细胞得以被清除。Annexin V为一种磷脂结合蛋白，可特异地识别细胞表面外翻的磷脂酰丝氨酸，所以经常被用于检测细胞凋亡［4］。Rh123是一种亲脂性阳离子，可发射绿色荧光，它可被线粒体吸收，并且其吸收量与线粒体电位ΔΨm成正比。正常的活细胞因为线粒体电位ΔΨm高，所以其摄入的Rh123也高，因此细胞会发出绿色荧光。而细胞发生凋亡时线粒体电位ΔΨm会降低，细胞表现为Rh123低染［5］。本研究结果显示，苦参碱处理RPMI8226细胞48小时时凋亡细胞明显增高， ΔΨ m明显降低，这说明细胞大部分是通过诱导细胞凋亡而死亡的，苦参碱还可通过线粒体信号通路，即内源性凋亡途径诱导RPMI8226细胞凋亡。
本研究通过形态学观察、Annexin?V分析、DNA琼脂糖电泳，线粒体膜电位检测证明，苦参碱能够有效地诱导RPMI8226细胞株凋亡，凋亡率与药物剂量和作用时间呈依赖性。通过线粒体跨膜电位我们推断，苦参碱通过线粒体信号通路诱导RPMI8226细胞凋亡，具体诱导凋亡机制尚在进一步研究中。
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3Hu ZL, Zhang JP,Qian DH, et al. Effects of matrine on mouse splenocyte proliferation and releasa of interleukin?1 and ?6 frome peritoneal macrophages in vitro (in English). 中国药报, 1996; 17 : 259-261
4Nicoletti I, Migliorati G, Pagliacci MC, et al. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. J Immunol Methods, 1991;139:271-279
5Kroemer G, Zamzami N, Susin SA. Mitochondrial control of apoptosis. Immunol Today, 1997; 18:44-51
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8张彦，蒋纪恺,刘小珊等. 苦参碱诱导K562白血病细胞分化和凋亡的实验研究. 癌症，2000; 19：756-758
9冯骥良，黄高升，张永清等. 苦参碱抑制JM细胞株增殖和诱导凋亡的研究. 中国中药杂志，2003; 28：437-442
