葛根素对人视网膜色素上皮细胞增殖及DNA合成的影响

           作者：李雯霖　姜德咏　陈忠平　张莉 

【摘要】  　　目的：葛根素对人视网膜色素上皮细胞增殖及DNA合成的影响。方法：酶消化法分离人RPE细胞，进行形态学观察并用免疫组织化学法做抗人角蛋白抗体鉴定，取3～8代细胞用于实验。细胞计数法检测不同浓度（0，0.01，0.1，1g/L）葛根素作用24h和0.1g/L葛根素在不同时间（24，36，48，72h）对人RPE细胞增殖活性的影响，并出相应的细胞增殖抑制率。四唑盐（MTT）比色法检测葛根素作用24h对人RPE细胞增殖活性的影响。用3H胸腺嘧啶核苷（3H thymidine， 3H-TdR）掺入法检测葛根素作用24h对人RPE细胞DNA合成的影响。结果：葛根素以剂量和时间依赖方式抑制人RPE细胞增殖，经统计学分析，0.01g/L以上浓度葛根素均能显著抑制人RPE细胞增殖(P ＜0.01)及DNA合成(P ＜0.01)。结论：葛根素显著抑制人RPE细胞增殖及DNA合成。

【关键词】  葛根素　药　视网膜色素上皮细胞　增殖

　　 Effect of puerarin on proliferation and DNA synthesis of human retinal pigment epithelial cells

        Abstract AIM: To investigate the effect of puerarin on proliferation and DNA synthesis of human retinal pigment epithelial (RPE)cells.  METHODS: Human RPE cells were cultured by enzymatic dissociation methods, the purity of cultured human RPE cells were assessed morphologically and confirmed by immunohistochemical staining for human cytokeratin, subcultures between 3 and 8(P3-8) were used in the study. Counting cell numbers was used to determine the effect of puerarin on the growth of human RPE cells at different concentration(0,0.01,0.1,1g/L) and for different time（24，36，48，72 hours）.The arrest rate of human RPE cell proliferation by puerarin was determined. The tetrazolium dye- reduction assay(MTT) was used to determine the effect of puerarin on human RPE cell surviral and proliferation for 24 hours at four concentrations. The [3H]thymidine incorporating was used to determine the effect of puerarin on the DNA synthesis of human RPE cells for 24 hours at four concentrations .RESULTS: Puerarin inhibited proliferation of human RPE cells in a dose and time-dependent manner in vitro. The inhibitory effect on the proliferation and DNA synthesis of human RPE cells was statistically significant at concentrations above 0.01g/L (P <0.01) .  CONCLUSION: Puerarin can significantly inhibit the proliferation and DNA synthesis of human RPE cells..

    · KEYWORDS: puerarin; pharmacology; retinal pigment epithelial cell; proliferation

　　0引言

    增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy,PVR）是一种常见的致盲眼病，细胞增殖是PVR的病理特征。视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞是参与 PVR中视网膜前膜（epiretinal membranes,ERM）的主要细胞成分。葛根素具有扩血管、促进血液循环、改善微循环等主要作用，已广泛用于临床，但有关葛根素的细胞作用研究报道不多。我们观察葛根素对人RPE细胞增殖活性的影响，以了解它的细胞抑制作用。

    1材料和方法

    1.1材料 葛根素为药品生物制品检定所提供的标准品，纯度大于99%；鼠抗人角蛋白mAb 、S-P超敏试剂盒及DAB显色试剂盒购自福州迈新公司；二甲基亚砜(DMSO) 和 MTT 购自Sigma公司；3H-TdR购自中国原子能研究所；胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司。RPE细胞取自20～40岁意外死亡后12h内作角膜移植的供体眼（知情者同意）， 将视网膜色素上皮层剥离，用2.5g/L胰蛋白酶消化后，离心，弃上清液，用含200mL/L胎牛血清的DMEM（Dulbecco’s modified Eagle’s medium ）培养液重悬细胞，接种25mL培养瓶中，置于37℃、50mL/LCO2、950mL/L空气的孵育箱中孵育。细胞生长近融合时，按1：2传代，传代细胞用100mL/L胎牛血清DMEM继续培养，取3～8代细胞用于实验。用链霉亲和素-生物素化-过氧化酶法（SP法）行鼠抗人细胞角蛋白免疫细胞化学鉴定，获得纯度高达100%的RPE细胞。

    1.2方法 取4～6代RPE细胞用含100mL/L胎牛血清的DMEM制成5×107/L的细胞悬液，接种于24孔塑料培养板，孵育24h后弃上清液，分别加入终浓度为0.01，0.1，1g/L的葛根素且不含胎牛血清的DMEM液，对照组加入等量不含胎牛血清的DMEM培养液，培养24h，2.5g/L胰蛋白酶消化制成细胞悬液，台盼蓝染色计数，按如下公式计算不同浓度药物对细胞增殖的抑制率(%)=(1－实验组A均数/对照组A均数)×100%。另接种细胞孵育24h后弃上清液，加入终浓度为0.1g/L葛根素且不含胎牛血清的DMEM液，对照组加入等量不含胎牛血清的DMEM培养液,继续孵育24，36，48，72h计数，按上述公式计算不同时间药物对细胞增殖的抑制率。另接种细胞于96孔板中，孵育24h后弃上清液，加入不含胎牛血清的DMEM继续孵育12h，用于实验，分别加入终浓度为0.01, 0.1, 1g/L葛根素且不含胎牛血清的DMEM培养液，对照组加入等量不含胎牛血清的DMEM培养液，孵育24h，每孔加入5g/L MTT溶液20μL，继续培养4h，终止培养后，吸弃上清液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μL终止反应，微型震荡器震荡10min，立即在酶联免疫仪上测定各孔的光吸收值，波长为490nm。计算药物对细胞增殖的抑制率。同上接种细胞于24孔培养板，孵育24h后弃上清液，分别加入终浓度为0.01,0.1,1g/L葛根素且不含胎牛血清的DMEM培养液，对照组加入等量不含胎牛血清的DMEM培养液，培养24h，每孔加入3H-TdR100μL,使之终浓度为3.7×1010Bq/L，继续培养12h，收集细胞于玻璃纤维膜上，进行漂洗、脱色、烤干，置入闪烁杯中，加入二甲苯闪烁液，用液体闪烁计数仪测定每分钟脉冲数(cpm)。以上各组实验均重复3次以上。

    统计学处理：所有数据均用SPSS11.0软件进行统计分析。数据以平均值±标准差( )表示，进行t检验和方差分析，显著性检验以P＜0.05有意义。

    2结果

    2.1葛根素对人RPE细胞的影响 不同浓度葛根素 (0.01，0.1，1g/L)分别作用于RPE细胞24h，与对照组相比,葛根素对RPE细胞增殖的抑制作用具有显著性差异(P＜0.01)，其抑制强度随药物剂量的增加而逐渐增强,分别为3.9%，20.6%，27.4%(表1)。贴壁生长良好的RPE细胞在给药后12h即可见部分细胞脱落，在24，36，48，72h，0.1g/L葛根素对RPE细胞增生的抑制效应随时间而明显增强，与24h及空白组比较，其抑制效应均有显著性差异(P＜0.01,表2)。

    2.2 葛根素抑制RPE细胞增生 葛根素作用于RPE细胞24h,MTT法检测有显著的抑制作用 ，且随药物浓度的增加而逐渐增强（表1）。另葛根素作用于RPE细胞后均使细胞3H-TdR掺入量减少(P ＜0.01)，其抑制效应随药物浓度的增加而逐渐增强(表1)。

    3讨论

    PVR是指在裂孔源性视网膜脱离或视网膜复位手术后，由于RPE细胞及神经胶质细胞的增生和收缩的病理过程，它可以造成视网膜裂孔、出血或牵拉性视网膜脱离而严重危害视力[1]。Kirchhof 等[2] 发现RPE细胞的迁移和增殖在PVR的病理改变中扮演着极其重要的作用。 在PVR时，血—视网膜屏障遭到破坏，RPE细胞暴露于血清中的各种生长因子和细胞因子中，活化而出现增殖。因此，RPE细胞在视网膜的增殖性疾病中具有重要作用，其异常增殖是许多增殖性视网膜疾病增殖膜形成的重要病基础。葛根素(puerarin,Pue)是从豆科植物葛的根中提取的一种异黄酮成分，具有扩血管、促进血液循环、改善微循环等主要作用。近几年药理研究表明，葛根素具有如下显著药理作用[3,4]：抑制TNF-α和IL-1β诱导的粘附分子表达[5]；抑制低密度脂蛋白氧化修饰的作用与其清除活性氧自由基有关，葛根素对活性氧如羟自由基和超氧阴离子有清除作用;通过调节一氧化氮合酶(NOS)活性使NO增高; 具有降血脂和抗氧化作用;对氧自由基有清除作用。我们通过细胞计数法、MTT比色法和3H-TdR掺入试验探讨葛根素对RPE细胞增殖及细胞内DNA合成的影响，结果发现葛根素对培养的RPE细胞增生具有抑制作用，且随药物浓度的增加和作用时间的延长，其抑制作用增强，存在时间和剂量依赖关系；另外，葛根素还抑制RPE细胞DNA合成，呈剂量依赖关系。在实验中我们发现贴壁生长良好的RPE细胞在给与葛根素干预后12h即可见部分细胞脱落，而贴附是贴附型细胞生长增殖的条件之一，通常细胞表面有由细胞分泌的糖蛋白膜，即细胞外衣，它对细胞运动尤其是贴附于支持物生长有重要作用。细胞外衣的性质与细胞物质交换、酸碱失衡及膜电位等有关，改变细胞外衣的性质可使细胞由支持物上脱落下来。研究表明RPE细胞中游离钙的浓度调节细胞吞噬功能状态、细胞增殖及细胞与基底膜的粘附力[6]，由此推测葛根素可能改变膜电位和细胞外衣的性质及细胞内钙浓度而引起细胞粘附力和增殖力下降。由于正常活细胞线粒体内琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物(formazan),且细胞存活数与其产生的MTT结晶物A值之间存在线性关系，MTT比色法发现,给药组细胞MTT结晶物产生量少于对照组，A值明显低于对照组,三种不同浓度的葛根素对RPE细胞增殖的抑制作用逐渐增强；同时，3H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DNA合成代谢过程，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞DNA的代谢及细胞增殖情况。3H-TdR掺入试验表明，与对照组比较，给药组RPE细胞3H-TdR掺入量显著减少，3种不同浓度的葛根素使RPE细胞的3H-TdR掺入量分别减少了2.6%，15.5%和22.4%，进一步证实了葛根素可干扰细胞代谢，抑制细胞内DNA合成，但本实验结果也表明,葛根素并不是完全通过抑制DNA合成来抑制RPE细胞增殖的，其确切机制还需进一步研究。

【】
  1陈晓,洪玲,金中秋.玻璃体切除术牵拉性视网膜脱离34例.国际眼科杂志,2005;5(5):964-966

2 Kirchhof B, Kirchhof E, Ryan SJ, Sorqente N. vitreous modulation of migration and proliferation of retinal pigment epithelial cells in vitro.Invest Ophthalmol Vis Sci ,1989;30:1951-1957

3崔岚,祝镇秋,陶达人.葛根素药理作用研究进展.药师,2004;7:924-927

4李雯霖,姜德咏,郭丽花,王平,张莉.葛根素抑制糖基化终产物诱导的人视网膜色素上皮细胞增殖及低氧诱导因子-1α的表达.国际眼科杂志,2006;6(3):580-583

5 Nagasaki H, Shinagawa K, Mochizuki M. Risk factors for proliferative vitreoretinopathy. Prog Retin Eye Res ,1998;17:77-98

6 Kennedy BG, Mangini NJ.Plasma membrane calcium-ATPase in cultured human retinal pigment epithelium. Exp Eye Res ,1996;63:547-556