色素上皮源性因子对缺血—再灌注视网膜神经节细胞的保护作用
作者：李文化 杨永升 李海燕 马涛
【摘要】 目的：研究色素上皮源性因子（pigment epithelium derived factor，PEDF）对高眼压诱导的大鼠视网膜缺血—再灌注后视网膜神经节细胞的保护作用。方法：经眼角膜进行前房平衡盐水（BSS）灌注，维持眼内压110mmHg，以阻止视网膜正常血液灌注。60min后取出灌注针头，恢复视网膜正常血流，从而建立大鼠视网膜缺血—再灌注模型。实验分为正常非缺血组和视网膜缺血—再灌注组，后者又分为生理盐水注射对照组和PEDF注射实验组，再灌注模型建立后立即向实验组大鼠玻璃体腔内注射0.2g/L PEDF 2μL。实验对照组用同样方法注射等量生理盐水。分别于注射后2d和7d进行眼球摘除，对视网膜进行光学显微镜形态学观察和Fas原位杂交免疫学分析，探讨PEDF对缺血—再灌注视网膜神经节细胞的保护作用。结果：缺血—再灌注2d时生理盐水注射组和PEDF注射组视网膜神经节细胞明显少于正常对照组(P ＜0.01)和(P ＜0.05)，PEDF注射组视网膜神经节细胞数较生理盐水注射组明显较多，相比有显著性差异（P ＜0.05）；视网膜神经节细胞计数再灌注7d后结果与2d时类似。再灌注2d生理盐水注射组Fas阳性染色细胞比PEDF注射组明显较多（P ＜0.05），生理盐水组比PEDF注射组阳性细胞百分率明显较高(P ＜0.01)；再灌注7d时两组Fas阳性细胞计数无明显差异。结论：视网膜缺血—再灌注后即刻行玻璃体腔内PEDF注射可以改善视网膜神经节细胞的损伤并有一定保护作用。
【关键词】 视网膜缺血—再灌注损伤 色素上皮源性因子 凋亡 Fas
Pigment epithelium derived factor as a neuroprotective agent against Ischemic-reperfusion induced retinal gonglion cell injury
Abstract AIM: To determine whether PEDF is neuroprotective for retinal neurons that are exposed to transient pressure induced ischemia-reperfusion. METHODS: Transient retinal ischemia was produced by increasing the intraocular pressure for 60 minutes in SD rats eyes，immediately after reperfusion，PEDF was injected intravitreally into the experimental eyes. Injury was evaluated morphologically and by counting the number of the retinal ganglion cells(RGC) and number of Fas staining cells. RESULTS: Morphologically，RGCs appeared turbulence and capsular changes and morphmetrically， the number of RGCs were significantly protected at 2 and 7 days in PEDF injected eyes. Fas in situ Hybridization showed the number of positive stained cells in PEDF injected eyes was obviously less than the vehicle injected eyes. CONCLUSION: PEDF injection immediately after ischemic-reperfusion can ameliorate retinal gonglion cells injury. It may be useful in preventing neuronal damage in the retinal gonglion cell layer induced by retinal ischemia.
· KEYWORDS: retina ischemic-reperfusion; pigment epithelium derived factor; apoptosis; Fas
0引言
视网膜神经节细胞（retina ganglion cells，RGCs）的损伤是青光眼眼内压异常升高对视网膜造成的主要病理损害，该损害以视网膜神经节细胞的凋亡为主要形式[1]。临床上常见到许多青光眼患者眼压控制正常后视野仍在继续丧失，这个现象可以由眼内神经营养因子的剥夺、谷氨酸释放等原因解释，但这多种原因最后均可以导致视网膜神经节细胞的凋亡。及时有效地控制视网膜神经节细胞的异常凋亡成为当今研究青光眼发病治病的重要课题。有研究者给实验动物眼内注射外源性神经营养因子PEDF以保护神经节细胞并缓解神经节细胞的异常凋亡[2]。也有报告观察到药物对压力诱导的视网膜缺血、神经节细胞凋亡的保护作用[3，4]。色素上皮源性因子（PEDF）是一种可溶性糖蛋白，由Steele等[5]在1993年从人胎儿视网膜色素上皮细胞体外培养液中分离提纯出来的。它是唯一具有神经营养功能的丝氨酸蛋白水解酶抑制因子超基因家族成员，视网膜光感受器细胞间质是PEDF最主要的贮存部位[6] 。已证明它与缺氧关系密切，具有神经保护，促进胚胎神经分化，抑制视网膜脉络膜新生血管等作用。但PEDF对压力诱导的视网膜缺血—再灌注的神经损伤的保护作用仅见个别报道[2,7]。我们将利用大鼠视网膜缺血—再灌注模型进行相关实验研究。
1材料和方法
1.1材料 取质量200～220g SD大鼠30只（由山西医科大学动物室提供），雌雄不限，氯胺酮和异丙嗪注射液按3∶1比例ip麻醉后，眼局部用5g/L爱尔卡因表面麻醉滴眼液和4g/L庆大霉素滴眼液点眼以预防感染，用25G灌注针头距角巩膜缘0.5mm处作角膜前房穿刺，针头斜面向上以避免损伤虹膜及晶状体。针头通过硅胶管与灌注瓶连接，再利用三通管连接便携式压力计，通过升高灌注瓶的高度调节眼内压力，使其维持在110mmHg。根据以下情况判断高眼压模型的成功建立:眼角膜呈淡雾状混浊，前房变深，眼底红光反射消失，呈灰黄色反光。直接检眼镜观察眼底视网膜动脉变银丝状，视网膜颜色变淡，证实视网膜血管断流，视网膜缺血产生。维持该眼压60min后，拔除灌注管，观察角膜逐渐清亮，眼底红光反射出现，直接检眼镜检查视网膜动脉再灌注恢复正常，视网膜色泽正常，确定高眼压视网膜缺血—再灌注模型建立。其中有6只大鼠作为正常对照。
1.2方法 PEDF由美国upstate 公司通过晶美生物制品公司提供。使用前在-80℃超低温冰箱保存。使用时用生理盐水进行稀释至250g/L，各分装入Eppendovf管内置于-80℃超低温冰箱待用。注射前从超低温冰箱取出，解冻， 所有动物均取右眼作为实验对象。视网膜缺血—再灌注模型建立后，立即在显微镜下进行眼内PEDF玻璃体腔内注射2g（/4L），注射方法如下：对所有实验对象用玻璃微电极于眼球的颞上象限距角膜缘向后2mm处与眼球表面呈45°进针以避免刺伤晶状体，缓缓注射，注射终止时将玻璃微电极停留30s以防止注射液外漏。拔出微电极，观察注射部位无渗漏，无出血。观察眼球：角膜清亮，屈光间质清，眼底视网膜反光正常，血管走行及充盈正常。对照组注射等量生理盐水。注射结束后用4g/L庆大霉素眼药水点双眼以预防感染。完成实验全过程的眼球进行摘除。摘除前用同样方法进行动物麻醉，显微镜下进行眼部检查，除4眼在球内注射部位球结膜轻度充血外，其余眼表面及前节均未见明显异常。直接检眼镜检查眼后节也未见明显异常，随后摘除眼球，立即浸泡于40g/L甲醛液中固定。常规脱水浸蜡，石蜡包埋全眼球，自后（视神经）向前沿冠状面进行6μm连续切片备用。进行普通HE 染色，光镜下观察，Fas原位杂交免疫染色（试剂盒美国Upstate 公司通过晶美生物制品公司提供）：（1）石蜡切片脱蜡至水后30mL/L H2O2过氧化物酶室温孵育20min；（2）0.01mol/L PBS冲洗切片后消化液室温孵育20min。（3）0.01mol/L PBS冲洗切片后滴加预杂交液37℃湿盒孵育2h，0.01mol/L PBS冲洗后滴加杂交液 37℃湿盒孵育1h，2XSSC冲洗后滴加杂交液 37℃湿盒孵育1h，0.01mol/L PBS冲洗滴加封闭液室温孵育15min，PBS冲洗1次，滴加生物素化抗地高辛抗体4℃过夜；（4）0.01mol/L PBS冲洗后滴加高敏TSPZYMEDSABC酶复合物，37℃湿盒孵育40min，冲洗后滴加DAB显色5min，水洗终止，苏木素复染核，脱水，封片，显微镜下观察结果。为评价视网膜缺血损害的神经节细胞丢失程度，按照报道[7]的方法测定视网膜神经节细胞的密度。在光学40倍显微镜下计数并分析；Fas染色阳性细胞在400倍光学显微镜下计数并分析。
统计学处理：视网膜神经节细胞计数及Fas阳性染色细胞计数及染色率分析均利用成组资料均数比较t检验，P <0.05为有显著性差异。
2结果
2.1光镜检查 光镜下正常大鼠视网膜结构与人视网膜结构相似，有完整的10层结构。视网膜各层结构清晰，排列整齐，外颗粒层细胞最多，非常致密，神经节细胞层细胞最少，大小不一，呈圆形或椭圆形，分单层或多层排列(图1)。再灌注后2d，生理盐水注射组可见视网膜神经节细胞丢失，排列稀疏，囊样变较明显（图2A）。7d组视网膜神经节细胞光学改变与2d组类似（图2B）。PEDF注射组2d时神经节细胞层较生理盐水2d及7d注射组均明显增厚，细胞数量明显增多，细胞排列较紧密，仅见少量囊样变（图2C）。PEDF治疗后7d，视网膜神经节细胞层跟对照组相比细胞排列均匀整齐，较致密，囊样变现象不明显（图2D）。
2.2 FAS原位杂交分析 抗FAS阳性染色均位于细胞质内，呈棕黄色，细丝状，分布不均匀，细胞核呈灰蓝色。凋亡细胞阳性信号为覆盖整个细胞核的深蓝色着色及细胞质的棕黄色着色。生理盐水注射组，视网膜缺血—再灌注2d， FAS原位杂交图片显示较多阳性染色的视网膜神经节细胞，散在分布，胞体较正常略大（图3A）; 7d组也可见阳性染色细胞，但数量较2d组较少（图3B）。PEDF治疗组，视网膜缺血—再灌注2d，仍然可见散在阳性染色细胞，数量较生理盐水组明显减少（图3C）；再灌注7d，阳性细胞虽偶然可见，大部分切片中未发现阳性细胞(图3D)。
2.3视网膜神经节细胞计数 再灌注2d时缺血—再灌注生理盐水注射组（15.4±6.8）和PEDF注射组（23.8±7.4）视网膜神经节细胞明显少于正常对照组（36.3±10.5）， (t =4.71, P <0.01)和(t =2.72, P <0.05)；PEDF注射组视网膜神经节细胞数较生理盐水注射组明显较多，相比有显著性差异（t =2.38, P <0.05）。再灌注7d后结果与2d时类似。2.4大鼠视网膜神经节Fas阳性细胞数 再灌注2d生理盐水注射组Fas阳性染色细胞比PEDF注射组明显较多（P ＜0.05， 表1）；再灌注2d生理盐水比PEDF注射组之间阳性细胞百分率明显较高（P <0.01，表1）
图1 正常大鼠对照眼视网膜，箭头为神经节细胞层HE×40
3讨论
临床上目前尚未发现治疗缺血—再灌注造成的视网膜神经节细胞损伤的有效的方法。眼睛是机体中一个相对独立的解剖结构，而血—视网膜屏障又成为全身及眼球表面用药使药物释放入眼内的主要屏障。而经玻璃体腔注射药物即可穿过该屏障，迅速作用于靶器官—视网膜以达到快速有效治疗的目的。本实验即利用了这一原理，通过该途径探讨了PEDF对缺血—再灌注视网膜损伤的保护作用。早在1952年Smith 等[8]就利用前房加压灌注制作眼缺血—再灌注模型，之后经过多年的重复和改良后被广泛使用[2，4，9]。此法目的是增加眼球内容物的体积，压迫视网膜血管，使视网膜微循环压力升高。正常状态下视网膜循环压力低于体循环舒张压，故视网膜血液持续灌流，当眼内压升高使视网膜循环压力等于甚至高于体循环压时，视网膜血流中断，导致视网膜缺血，此方法引起的视网膜缺血彻底，对动物创伤小，可重复性强。本组
24只大鼠均达到了理想的眼内压，经过检眼镜及显微镜检查亦确定了视网膜血流的中断及缺血状态的存在，为实验的顺利进行打下了良好的基础。缺血—再灌注损伤不仅发生在心肌缺血—再灌注时，在其他器官，如脑、胃肠道、肾、肝、视网膜等均可发生缺血—再灌注损伤。视网膜组织主要成分为神经组织，视网膜的中央动脉为终末动脉，因此，视网膜缺血和循环障碍可以导致视网膜的严重损伤。
视网膜缺血后可引起视网膜一系列分子生物学改变和病理改变。临床上常见的青光眼即是由于眼内的压力异常增高并持续一定时间所导致的视神经的损坏，它和其它所有视神经疾病共有一个特征，即视网膜神经节细胞的进行性死亡。大量高眼压动物实验中对视网膜神经节细胞的病理光镜和电镜显示，正在死亡的细胞所展示的许多特征与已知的凋亡相一致。Quigley等 [10] 用TUNEL法来辩识猴实验性青光眼神经节细胞中的DNA片段，结果显示TUNEL阳性的视网膜神经节细胞至少是对照眼的10倍，有力地支持了青光眼视网膜神经节细胞的死亡是凋亡，并且有实验显示该凋亡在模型建立后6h内即有发生[11]。我们发现，视网膜缺血—再灌注2d生理盐水注射组可见神经节细胞的严重细胞丢失，细胞密度降低、囊样变以及FAS阳性染色细胞明显增多。随着再灌注后时间的延长神经节细胞密度未见明显变化但FAS 阳性染色细胞明显减少，说明细胞的凋亡是视网膜缺血-再灌注早期神经节细胞死亡的主要方式[12]。Fas 是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)受体和神经生长因子(nerve growth factor，NGF) 受体家族的细胞表面分子，Fas 配体(Fas ligand，FasL)是TNF家族的细胞表面分子。Fas 分子为典型的型膜蛋白，胞内段存在传递死亡信号的死亡域。FasL与其结合后，通过死亡域传递细胞死亡信号，引起Fas表达的细胞凋亡。已有研究表明眼角膜全层FasL表达阳性，视网膜神经细胞也表达FasL阳性，视网膜色素上皮细胞呈弱表达[13]。我们应用Fas的这一分布以及表达特性，确定了高眼压视网膜缺血—再灌注模型中与Fas相关神经节细胞的凋亡存在以及PEDF对该凋亡的明显抑制Ｇ作用。对视网膜缺血—再灌注损伤的治疗原则是在缺
血—再灌注发生后尽早进行细胞保护，防止再灌注损伤的发生。我们应用具有神经保护作用的色素上皮源性因子（PEDF）进行一定量眼内注射，目的在于减轻视网膜缺血—再灌注对视网膜神经节细胞的损伤。PEDF是Steele等[5]从人胎儿视网膜色素上皮细胞（RPE）体外培养液中分离，提纯出来的。它是一种可溶性糖蛋白，相对分子量 46 000。PEDF是唯一的一种神经营养功能的丝氨酸蛋白水解酶抑制因子超基因家族。它广泛存在于全身许多组织，在眼中多个组织中也广泛分布，在眼球内玻璃体腔中的浓度很高。目前对PEDF 在眼组织内的表达和作用的研究结果证明它在早期视网膜脉络膜新生血管眼内的表达增高[14]并且与血管内皮生长因子（VEGF）的存在呈负相关性[15，16]，表明PEDF在脉络膜新生血管生成过程中起着抑制作用 。 Ogata等[15]通过采集增殖性糖尿病性视网膜病变玻璃体并进行PEDF 和VEGF的含量测定发现，PEDF的含量明显低于VEGF的含量并提示这种负相关对眼内增殖性病变也起着重要作用。PEDF除了抑制新生血管及增殖性病变外，还可诱导细胞凋亡[17]。它能够诱导体外培养的血管内皮细胞凋亡，也能促进活体缺血视网膜内皮细胞的凋亡。而我们则是利用了PEDF的神经保护、营养作用探讨其在缺血性视网膜损伤中的作用。Cayouette 等[18]证实了PEDF在光感受器形态发生中的重要保护作用。之后Taniwaki等[19]也发现PEDF对短期高眼压引起的缺血—再灌注视网膜损伤有部分保护作用。PEDF的生物学特性以及其在眼内组织中的活跃状态，激发了人们利用它的神经保护作用和眼局部应用的安全性进行进一步的研究以解决眼科临床上相关眼病。
已有研究证明，给大鼠玻璃体腔内预先注射微量腺病毒介导的色素上皮源性因子，在大鼠视网膜再灌注7d后观察发现，PEDF注射组视网膜厚度及神经节细胞密度明显高于未注射组[20]，证明PEDF 对视网膜缺血—再灌注损伤有抑制作用。本实验结果表明，视网膜缺血—再灌注后立即行眼球内PEDF注射在再灌注后2d及7d时神经节细胞的计数较对照组明显增多(P <0.05)，FAS免疫染色阳性细胞数却较对照组明显减少（P <0.01）。然而在两组再灌注后7d时FAS阳性细胞数及阳性率却没有明显差异。该结果进一步证实了PEDF 对视网膜缺血—再灌注早期损伤具有一定的保护作用，而晚期视网膜的改变则可能以神经节细胞的变性、坏死为主的理论[1]。
视网膜缺血—再灌注后又可以诱发机体以及眼局部自身的代偿保护机制，例如：热休克蛋白HSP70mRNA的高表达[21]以及机体抗氧化系统的活化等[22]，而这些自身保护因子的作用又可以减轻或延缓这种眼压升高而引起的视网膜缺血—再灌注损伤，因此，再灌注后视网膜神经节细胞形态及功能的恢复并非单一保护因子的作用。由于两实验组2d和7d时RGC计数相比无明显差异，由此推测可能存在多种因子对RGCs的保护作用。众所周知，神经营养因子的保护作用有剂量依赖性，需要重复使用才可以达到长期的神经保护作用[23]。因此寻求一种长期有效的方法及途径，是今后研究工作的重要方向。由于本实验条件有限，尚未涉及到视网膜缺血—再灌注模型动物PEDF干预后对视功能的影响，不同剂量PEDF对眼内组织有无毒性作用及在眼内存留时间，干预后在眼组织内分布等，还有待在今后的实验中进一步研究以早日为广大青光眼患者及各种疾病引起的视神经的损伤提供可靠而有效的治疗方法。
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