榄香烯乳联合足叶乙甙对视网膜母细胞瘤HXO-RB44 细胞凋亡及survivin表达的影响
作者：魏为 唐罗生 李立 杨一涛 王文军
【摘要】 目的：观察榄香烯乳联合足叶乙甙对视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞凋亡及survivin表达的影响及其作用机制。方法：采用榄香烯乳、足叶乙甙单药及两者联合处理视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞，观察HXO-RB44细胞生长情况并采用四甲基偶氮唑蓝（MT）结果：HXO-RB44细胞经榄香烯乳、足叶乙甙及两者联合处理后，细胞增殖受到不同程度的抑制(r =0.963，P ＜0.05)，survivin蛋白表达下降(P ＜0.01)；其中以两者联合用药最为显著。结论：榄香烯乳联合足叶乙甙能协同抑制HXO-RB44细胞的增殖，并可能下调survivin的表达，促进细胞的凋亡，抑制RB细胞系增生。
【关键词】 榄香烯乳 足叶乙甙 视网膜母细胞瘤 survivin 凋亡
Effect of elemene and/or etoposide on the expression of survivin and apoptosis of retinoblastoma HXO-RB44 cells
AbstractAIM: To investigate the effects of elemene and/or etoposide on the apoptosis of human retinoblastoma HRO-RB44 cell and the expression of survivin in vitro. METHODS: The HRO-RB44 cells were treated with elemene and/or etoposide for 24 hours, and then the proliferation was assessed by MTT method. The survivin expression were analyzed by flow cytometry and RT-PCR. RESULTS: Elemene and etoposide could inhibit the growth of HXO-RB44 cells, down-regulate the expression of survivin, and induce extensive apoptosis of HRO-RB44 cell. CONCLUSION: Elemene could enhance the effects of etoposide on proliferative suppression, survivin expression down-regulation, and apoptosis induction of HRO-RB44 cells.
· KEYWORDS: elemene; etoposide; retinoblastoma; survivin; apoptosis
0引言
视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，RB）是婴幼儿最常见的恶性肿瘤之一，严重危害患者的视功能并危及生命。目前化学药物在视网膜母细胞瘤眼内期病例的保守治疗，眼外期病例的辅助治疗，晚期病例的姑息治疗等方案中起到非常重要的作用[1-3]。近年来由于治疗方法的进步，RB眼球摘除率明显下降，保守治疗的机会增加，寻求有效的药物治疗仍是我们努力的方向。足叶乙甙（etoposide,VP-16）是新一代化疗药物，具有广谱的抗肿瘤活性，但全身大剂量的VP-16化疗能引起肝肾功能损害及骨髓抑制作用，甚至因全身大剂量化疗容易引起继发性恶性肿瘤的发生，最近Lee等[4]曾报道应用VP-16治疗后继发急性粒细胞性白血病。因此，探索低剂量多药联合应用，是肿瘤药物研究的一个重要方向[5]。榄香烯乳是从活血化瘀中药温莪术挥发油中提取的油状物单体，属于不含氮的倍半烯烃类，为国家二类抗癌新药。实验药及临床药理学都证实该制剂对多种肿瘤细胞有确切疗效[6]。我们采用榄香烯乳联合VP-16作用于视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞，观察两者对HXO-RB44细胞增殖、凋亡及survivin的表达的影响，研究两者联合用药对HXO-RB44细胞的凋亡及survivin的表达是否具有协同作用。
1材料和方法
1.1材料 HXO-RB44细胞株来自中南大学湘雅医学院肿瘤研究所。胎牛血清为美国Gibco公司产品，RPMI1640培养基购于美国Invitrogen公司。榄香烯乳注射液(elemene)由大连金港制药有限公司生产。VP-16 由齐鲁制药有限公司生产。抗人survivin多克隆抗体购自Santa Cruz公司。FITC购自北京中杉金桥公司。
1.2方法 视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞在37℃ CO2培养箱中培养。取对数生长期的HXO-RB44细胞，调整细胞浓度7.5×107/L,按每孔2 mL接种到6孔培养板中。实验分组：elemene处理组，VP-16处理组，elemene+ VP-16处理组，对照组。每组设6个复孔，分别于培养0、24、48、72h收集细胞。 将对数生长期的HXO-RB44细胞以7.5×107/L加入96孔培养板中,每孔加入180μL的细胞悬液，药物工作液20μL共3块，每组6孔/块），同时每块培养板设6孔对照孔，加入200μL细胞悬液；设6孔零孔，加入200μL培养液。实验孔分别加入不同药物，培养24、48、72h后，每日取出一块，每孔加入20μL MTT,作用4h后,加入DMSO100μL,孵育30min,在酶标仪492nm处测吸光度A值，按如下公式抑制率：细胞增殖抑制率=（1-处理孔A均数/对照孔A均数）×100%。另选取生长良好的细胞，调成5× 108/L的悬液，加入不同处理药物后，继续培养24h,收集细胞，加入兔抗人survivin单抗，阴性对照以PBS代替一抗，4℃孵育30min，PBS洗3遍后，用FACstar流式细胞仪检测荧光强度，每个标本检测10 000个细胞。
统计学处理：应用SPSS12.0软件对数据进行统计分析，对符合正态分布的平均数用均数±标准差（ ）表示。对多组均数比较采用单因素多水平设计定量资料的方差分析及相关分析。以P <0.05作为差异有统计学意义。
2结果
榄香烯乳联合VP-16对 HXO-RB44细胞的增殖抑制作用。与对照组相比各处理组HXO-RB44细胞的增殖均有不同程度的抑制，1mg/L的VP-16处理组较100 g/L的elemene处理组的抑制作用明显，而联合用药组较单药组抑制更明显（图1）。由此提示榄香烯乳联合VP-16具有协同抑制HXO-RB44细胞增殖的作用。榄香烯乳联合VP-16对 HXO-RB44细胞survivin表达的影响：当VP-16处理HXO-RB44细胞后，细胞表面的survivin表达阳性率较对照组下调，经elemene处理后，survivin表达阳性率亦下调，而当两者联合应用时survivin表达阳性率明显低于对照组(P＜0.01)。由此可见，榄香烯乳联合VP-16对 HXO-RB44细胞表面survivin表达具有明显的下调作用（图2）。
图1 榄香烯乳、VP-16处理组HXO-RB44细胞增殖抑制率
图2 A:elemene组HXO-RB44细胞survivin表达;B:VP-16组HXO-RB44细胞survivin表达;C: elemene+VP-16组HXO-RB44细胞survivin表达;D: 对照组HXO-RB44细胞survivin表达
3讨论
榄香烯乳是目前应用于临床疗效比较明确的国家二类抗肿瘤药物，在白血病等临床常见肿瘤的中，取得了肯定的疗效[7]。实验研究表明，榄香烯乳具有与抗代谢药物相似的特征，能降低肿瘤的分裂增殖能力，诱导肿瘤细胞凋亡，从而达到治疗肿瘤的目的[8]。本实验结果表明，榄香烯乳对HXO-RB44细胞有一定抑制作用。越来越多的研究表明恶性肿瘤的发生与细胞凋亡失衡有关，促凋亡基因活性受抑和抗凋亡基因被激活，是导致肿瘤细胞凋亡抑制而长期存活的主要原因。近年来新发现的一类细胞抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)广泛存在于许多物种中，survivin作为IAP家族的重要成员，是一种活性很强的凋亡抑制蛋白，具有不同于IAP家族其他成员的独特性质和结构，在细胞增殖与凋亡的联系上起着关键作用[9,10]。其通过直接或间接方式对caspases具有强大抑制作用而抑制了细胞凋亡，控制着线粒体依赖性凋亡途经——即所谓“体内途径”。已有研究显示，大多数正常组织均测不到survivin基因表达，而绝大多数癌组织存在survivin表达。在包括乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、黑色素瘤、白血病及淋巴瘤等60余种肿瘤细胞中，均有survivin表达[11]。我们的研究证实，survivin基因在视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞中有较高的表达，同时发现，在联合使用抗肿瘤药物VP-16和榄香烯乳后，survivin的高表达受到抑制，从而可能一定程度上促进视网膜母细胞瘤细胞的凋亡。综合分析HXO-RB44细胞增殖抑制率及survivin表达等实验结果，提示榄香烯乳和VP-16的联合应用，可能降低VP-16的剂量，减轻其毒副反应，从而为榄香烯乳和VP-16在视网膜母细胞瘤治疗中的联合应用提供了依据。
【】
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