bFGF对人晶状体上皮细胞中FAK表达的影响

           作者：王欣玲　于韬　张国刚　阎启昌　张劲松   

【摘要】  　　目的：观察不同浓度碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）引起体外培养的人晶状体上皮细胞迁移和黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）mRNA水平的动态变化。方法：体外培养的第3代人晶状体上皮细胞，建立细胞划痕损伤模型，经0，5，10，15μg/L bFGF作用8 ~16h后，电脑图像法测定细胞迁移距离，RT-PCR法检测0，1，4，8， 16h FAK mRNA水平，免疫荧光法检测整合素β1和增殖细胞核抗原表达阳性率的变化。结果：与对照组比，5μg/L组细胞迁移距离和FAK mRNA表达显著增加（P <0.05）；10μg/L组细胞整合素β1表达阳性率显著增加（P <0.05）；15μg/L细胞迁移距离和FAK mRNA显著降低（P <0.05）。结论：bFGF引起人晶状体上皮细胞迁移距离和FAK mRNA表达的变化。　

【关键词】  碱性成纤维细胞生长因子　上皮细胞　晶状体　黏着斑激酶　迁移

　　Effect of bFGF on expression focal adhesion kinase in human lens epithelial cells

        Abstract AIM: To observe the effects of different concentration basic fibroblast growth factor (bFGF) on human lens epithelial cells migration and the dynamic changes in focal adhesion kinase (FAK) mRNA level.METHODS: The scratch wound model of the third passage human lens epithelial cells was established and treated with bFGF of different concentrations (0, 5, 10 and 15μg/L) for 8-16 hour. The images of cell migration were quantitatively measured using a computer-assisted videomicroscopic system. The mRNA level of FAK was measured with reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) assay at 0, 1, 4, 8 and 16 hour. The positive expression of integrin β1 and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) were studied by immunofluorescent staining.RESULTS: The cell migration and FAK mRNA level were significantly stimulated when treated with bFGF at the concentrations of 5μg/L compared with the control group (P <0.05). The integrin β1 positive expression rate was significantly increased when treated with 10μg/L bFGF (P <0.05). The cell migration and FAK mRNA level was significantly inhibited when treated with 15μg/L bFGF (P <0.05).  CONCLUSION: The cell migration distance and FAK mRNA expression varies when the cells are treated with different concentration of bFGF. FAK plays an important role in human lens epithelial cells migration.

    · KEYWORDS: basic fibroblast growth factor; epithelial cell; lens; focal adhesion kinase; migration

　　0引言

    黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)是细胞黏着依赖的信号转导(adhesion-dependent signal transduction )中的酪氨酸蛋白激酶，属于非受体蛋白酪氨酸激酶，在大多组织细胞中皆有表达，参与调节细胞发育、生长、存活、凋亡、黏附、骨架重组等过程，是生长因子受体信号转导通路中的重要信号分子[1,2]。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor， bFGF) 是强效促细胞增殖因子，对细胞的黏附、迁移也有作用 [3,4]。我们探讨不同浓度bFGF引起体外培养的人晶状体上皮细胞损伤后迁移距离与FAK的动态变化，以揭示其对晶状体上皮细胞迁移与增殖的影响。

    1材料和方法

    1.1材料 DMEM和胎牛血清购自美国Hyclone公司，碱性成纤维细胞生长因子bFGF和RT-PCR相关试剂购自美国Gibco 公司，抗整合素β1 pAb，抗增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）mAb，四甲基异硫氰基若丹明（tetramethylrhodamine isothiocyanate， TRITC）标记的山羊抗家兔IgG和异硫氰基荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的山羊抗小鼠IgG购自美国Santa Cruz公司。使用的仪器包括Olympus BX51型荧光显微镜、Olympus CK40型倒置显微镜及数码摄影系统，Perkin Elmer PCR扩增仪，岛津UV-240紫外-可见分光光度计和Amersham pharmacia凝胶成像系统等。

    1.2方法 人晶状体组织来自医科大学眼科中心。取人晶状体前囊膜，组织块法细胞培养。取第3次传代细胞，建立细胞划痕损伤模型[1]。在培养的细胞中每瓶加入含10ml/L胎牛血清的培养液抑制细胞分裂增殖，排除细胞增殖对细胞迁移的影响。细胞迁移图像经电脑图像处理系统定量。细胞迁移速度用划痕两侧迁移的距离表示。加入不同浓度的bFGF，使培养液中bFGF的终浓度依次为0，5，10和15μg/L，在37 ℃，50ml/L CO2中培养8和16h，分别记录实验数据。RT-PCR引物：FAK（5'-TGACAGGGAGGATGGAAGTC-3'，5'- TACTCTTGCTGGAGGCTGGT-3'），GAPDH（5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' ，5'- CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3' ）。分别在1，4，8，16h抽提细胞总RNA后作逆转录。然后用PCR扩增仪进行PCR反应。94℃ 5min，94℃ 1min，68℃ 1min，72℃ 1min，30个循环；最后72℃延伸10min，4℃ 结束反应。10g/L 琼脂糖电泳，电泳结束后凝胶置凝胶成像系统中扫描图像入机中保存处理。第3代人晶状体上皮细胞培养16h后，PBS漂洗3次，每次5min，40g/L多聚甲醛固定30min后，PBS再漂洗3次，每次5min，5mL/L TritonX-100漂洗3次，每次 5min，100g/L BSA于4℃下封闭过夜。分别加1∶100(体积比)稀释一抗（整合素β1 或 PCNA抗体），37℃恒温孵育1h，5ml/L TritonX-100漂洗3次，每次5min，加入1∶100(体积比)稀释二抗（山羊抗家兔IgG-TRITC或山羊抗小鼠IgG-FITC），37℃恒温孵育40min，PBS漂洗3次，每次 5min，终止反应，甘油-PBS (9∶1，体积比)封片，荧光显微镜观察并拍照，记录整合素β1和PCNA的表达情况。

    统计学处理： 数据分析采用 SPSS10.0电脑软件包进行方差分析，Student’s t-检验和χ2检验来判断差异的统计学意义，P <0.05差异具有显著性。

    2结果

    2.1 bFGF对人晶状体上皮细胞迁移距离的影响 与对照组相比，5μg/L组细胞迁移距离明显增加（P <0.05），10 μg/L组细胞迁移距离变化不明显（P >0.05），15μg/L组细胞迁移距离明显减少（P <0.05，表1）。

    2.2 bFGF对人晶状体上皮细胞FAK mRNA灰度值的影响 RT-PCR的测定显示，用5μg/L bFGF处理后，FAK mRNA表达水平在1 和4h处与对照组相比明显上调（P <0.05），8和16h下降到对照组水平（P >0.05）。用10 μg/L bFGF处理后，在各个时间点测得的FAK mRNA表达水平与对照组相似（P >0.05）。15 μg/L bFGF处理后，与对照组比，FAK mRNA表达水平1h即明显下调，4、8、16 h FAK mRNA都呈低水平表达（P <0.05，表1）。

    2.3 bFGF对人晶状体上皮细胞整合素β1和PCNA表达的影响 经bFGF处理培养16 h后人晶状体上皮细胞整合素β1表达阳性率在10 μg/L组明显高于其它3组 （P <0.05）；PCNA在各bFGF处理组表达阳性率增加，但是各组间差异无统计学意义（P >0.05，表1）。整合素β1和PCNA的阳性表达（图1，2）。

    图 1 整合素β1在细胞表面呈点状分布（TRITC×200）

    图 2 PCNA主要分布在细胞核内（FITC×100）

    3讨论

    白内障囊外摘出或超声乳化术后的创伤修复，残留晶状体上皮细胞的增殖、移行、化生，分泌胶原形成后发性白内障会影响患者术后视力[4]。近年来大量实验资料显示bFGF作为一种对广泛来源于中胚层和神经外胚层细胞的有效促细胞分裂因子，无论在生理或病理状态下都对晶状体上皮细胞有极重要的作用。在白内障手术后，由于手术创伤造成晶状体上皮细胞及其周围组织损伤而使细胞内bFGF释放；同时晶状体囊膜损伤可使储存于细胞外间质的bFGF释放[5-8]，局部高浓度的bFGF将促使残留的HLEC增殖、移行及纤维化生，为后发性白内障的形成提供条件。bFGF对晶状体上皮细胞的作用具有多重性，在不同的浓度和培养条件下，表现出对于细胞的增殖、迁移、黏附的作用不同[5]。在本培养体系中，5μg/L 的bFGF促进了人晶状体上皮细胞的迁移速度，FAK mRNA的表达水平上调；10μg/L 的bFGF使细胞表面整合素β1表达的阳性率明显增加，提示细胞黏附作用的增强；15μg/L 的bFGF则降低了细胞的迁移速度和FAK mRNA的表达水平；这也说明了bFGF生理作用的多样性，对细胞的增殖、迁移和黏附发挥重要的调节作用。5μg/L bFGF短时间作用后即出现FAK mRNA的表达水平上调，15μg/L bFGF短时间作用后即出现细胞中FAK mRNA持续低水平表达，细胞迁移距离与FAKmRNA水平的变化具有相同的方向，提示FAK mRNA及蛋白水平的变化可能是不同浓度bFGF作用后，人晶状体上皮细胞迁移能力变化的原因之一。

    报道，以PCNA作为细胞增殖检测指标显示，bFGF有显著促人晶状体上皮细胞增殖作用[9]。但在本实验中，随着bFGF浓度增加，PCNA表达的阳性率增加，但是各组间差异不具有统计学意义，推测是由于培养液中胎牛血清浓度控制在较低水平，从而抑制了晶状体上皮细胞的增殖作用。本实验提示，低浓度bFGF (5μg/L)对体外培养的划痕损伤区细胞迁移起促进作用，此种作用与FAK mRNA表达上调有关，但是随浓度升高，此种作用消失。高浓度bFGF (15μg/L)反而对细胞迁移起明显的抑制作用，此时FAK mRNA表达也抑制。由此可见，FAK在bFGF引起的人晶状体上皮细胞迁移的双相调节中起重要作用。

【文献】
  1 Taylor JM, Mack CP, Nolan K, Regan CP, Owens GK, Parsons T. Selective expression of an endogenous inhibitor of FAK regulates proliferation and migration of vascular smooth muscle cells. Mol Cell Biol ,2001;21(5):1565-1572

2 Tamura M, Gu J, Pankov R. Shc and FAK differenttially regulate cell motility and directionality modulated by PTEN. J Cell Biol ,1999;146(4):389-403

3 Guo W M, Shang F, Liu Q, Urim L, Zhang M, Taylor A. Ubiquitin-proteasome pathway function is required for lens cell proliferation and differentiation. Invest Ophthalmol Vis Sci ,2006;47:2569-2575

4 Kampmeier J, Baldysiak-Figiel A, de Jong-Hesse Y, Lang GK, Lang GE. Effect of growth factors on proliferation and expression of growth factor receptors in a human lens epithelial cell line. J Cataract Refract Surg ,2006;32(3):510-514

5 Kouhara H, Hadari YR, Spivak-Kroizman T. A lipid-anchored Grb2-binding protein that links FGF-receptor activation to the Ras/MAPK signaling pathway. Cell ,1997;89:693-702

6 Nishi O, Nishi K, Ohmoto Y. Synthesis of interleukin-1, interleukin-6, and basic fibroblast growth factor by human cataract lens epithelial cells. J Cataract Refract Surg ,1996;22:852

7曲勃,张劲松. BFGF对人晶状体上皮细胞系内钙离子及IP3R,RyR的作用.国际眼科杂志,2005;5(2):235-238

8包睿,柳林.细胞因子与晶状体上皮细胞增殖.国际眼科杂志,2004;4(1):125-128

9 Shentu XC, Yao K, Sun Z, Yu H, Yang Y. The age-related effect of basic fibroblast growth factor on the proliferation of lens epithelial cells. Zhonghua Yanke Zazhi ,2000;36(5):341-343