大鼠晶状体上皮细胞中FGF受体表达的年龄变化
【摘要】 目的：探讨FGF受体在不同年龄SD大鼠晶状体上皮细胞中的表达及意义。方法：SD大鼠按1，3，6mo龄分为3组，采用晶状体前囊膜铺片方式，应用荧光免疫组化技术进行FGFR1荧光免疫组化染色，检测其蛋白水平的表达；采用剥取晶状体囊膜组织方法，应用RT-PCR技术检测FGFR1在转录水平的表达。结果：在蛋白水平，FGFR1于1mo龄组表达最强（IA = 125619±13818），3mo龄组表达明显减弱（IA =65681±5911），6mo龄组表达最弱（IA =46146±3691），组间差异显著 （P <0.05）；FGFR1在转录水平随着年龄增长也逐渐降低，1mo龄组为1.32±0.41，3mo龄组为1.01±0.33，6mo龄组为0.68±0.20，组间差异显著（P <0.05）。结论：FGFR1在大鼠晶状体上皮细胞中的表达随年龄的增长而减弱。
【关键词】 成纤维生长因子 成纤维生长因子受体 晶状体上皮细胞
Age-related expression of FGF receptor in rat lens epithelial cells: an in vivo study
Abstract AIM: To investigate the age-related expression of fibroblast growth factor (FGF) receptor in rat lens epithelial cells. METHODS: Sprague Dawley rats were divided into three groups according to their ages: 1-, 3- and 6-month-old groups. Immunofluorescence technique was used to detect the expression of FGFR1 in rat lens epithelial cells. RT-PCR was applied to identity the expression of FGFR1 mRNA in rat lens epithelial cells. Expression of FGF receptor was analyzed in the three groups. RESULTS: FGFR1 expression at protein and mRNA levels in 1-month-old group was the highest in the three groups. The FGFR1 protein and mRNA expression in 3-months-old group were lower than that of 1-month-old group. The FGFR1 protein and mRNA expression in 6-months-old group exhibited the lowest level in the three groups. CONCLUSION: There is a significant age-related decline in FGFR1 expression at protein and transcription levels in rat lens epithelial cells.
· KEYWORDS: fibroblast growth factors; fibroblast growth factor receptor; lens epithelial cells
0引言
成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factors，FGFs）参与晶状体上皮细胞的增殖、移行及分化行为，调控晶状体的发育及生理功能，FGF（包括aFGF和bFGF）通过与相应受体结合，引发信息传递，从而发挥其生物学作用。有关FGF，尤其是bFGF对晶状体上皮细胞增殖与分化的影响，已有较多的研究，我们拟通过RT-PCR与荧光免疫组化手段，从转录及蛋白水平检测大鼠晶状体上皮细胞中成纤维生长因子受体（FGF receptors）的表达，以及在不同年龄表达的变化，以了解FGFs与其受体间的关系。
1材料和方法
1.1材料 健康SD大鼠来自第三军医大学野战外科研究所实验动物中心，鼠龄1~6mo，雌雄不限，动物质量符合国家《实验动物管理条例》。根据鼠龄分为3个实验组，即1mo龄组（85~100g）、3mo龄组（280~310g）和6mo龄组（330~420g）。解剖显微镜（Leica MZ95），激光共聚焦显微镜（Leica TCS NT），PCR仪（Bio-Rad），水平电泳仪（Bio-Rad），凝胶成像仪（Bio-Rad）；FGFR1兔抗人多克隆抗体（武汉博士德），标记FITC羊抗兔IgG及碘化丙啶（北京中杉），Tripure（罗氏公司），RT-PCR试剂盒（Takara生物工程有限公司），PCR引物根据FGFR1 mRNA序列（S54008）进行设计（表1），内参引物根据GAPDH mRNA序列（NM002046）设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.2方法
1.2.1 FGFR1荧光免疫组织化学染色 SD大鼠经腹腔麻醉后，摘取双眼球，于角膜缘处剪开眼球壁，取出晶状体，在解剖显微镜下撕取前囊膜组织片，平铺于防脱载玻片上，细胞面朝外，以多聚甲醛固定1h；0.01mol/L PBS漂洗10min×2次，正常羊血清封闭30min，0.01 mol/L PBS漂洗10min，加一抗（FGFR1，1∶20），37℃孵育1h，室温过夜，0.01mol/L PBS漂洗10min×3次，加荧光二抗（羊抗兔/FITC，1∶50），37℃孵育1h，0.01mol/L PBS漂洗10min×3次，以碘化丙啶（PI）行胞核复染10min后，甘油封片，于激光共聚焦显微镜下观察并在相同条件下摄片；每个实验组取3只大鼠，共6个晶状体前囊膜铺片，以绿色荧光为阳性表达，每张玻片随机取3个视野摄片，利用Image-Pro Plus 6.0软件每个视野中绿色荧光的累积吸光度值（IA）。
1.2.2 FGFR1的逆转录-聚合酶链反应 总RNA提取：取2只大鼠共4个晶状体，剥取囊膜组织并剪碎，加入TriPure 1mL，振荡、混匀后室温静置5min，加入氯仿（分析纯）0.2mL，混匀后室温静置15min，离心（4℃，12 000g）15min，吸取上层透明液体约0.25mL，加入异丙醇（分析纯）1mL，混匀后室温静置10min，离心（4℃，12 000g）10min，弃上清液，加入750ml/L 乙醇1mL，混匀并离心（4℃，7 500g）5min，弃上清液，加入无水乙醇1mL，混匀并离心（4℃，7 500g）5min，弃上清液，加入DEPC水 10μL溶解，即得到所需总RNA。测A值（260/280nm）均在1.8~2.0间，提示RNA纯度理想，RNA浓度为0.12~0.14g/L，提示RNA含量较低。每个实验组各有8只大鼠，每组可获得4个RNA样本，进行逆转录及PCR扩增。逆转录（RT）：取总RNA 0.5μg，分别加入25mmol/L MgCl2 2μL，10×RT buffer 1μL，10mmol/L dNTP mixture 1μL，40U/μL RNase inhibitor 0.25μL，5U/μL AMV逆转录酶 0.5μL，2.5μmol/L Oligo-dT 0.5μL，补足去离子水，配制成10μL反应体系；经30℃反应10 min，42℃反应30min，99℃反应5min，5℃反应5min后，得到RT产物。PCR扩增：取1μL RT产物作为模板，分别加入5×PCR buffer 5μL，5U/μL Taq酶0.125μL，上游引物1μL，下游引物1μL，去离子水16.875μL，配制成25μL反应体系；先经变性94℃ 5min，再通过变性94℃ 30s，退火（FGFR1 59.1℃，GAPDH 58℃）30s，延伸72℃ 45s，循环35次，最后再延伸72℃ 10min，得到PCR产物；各取PCR产物7μL，经15g/L琼脂糖凝胶电泳（80V，1h），凝胶成像仪摄片并计算目的条带吸光度值，以GAPDH吸光度值作为标准对比。
统计学处理：所得数据利用SPSS 8.0软件，采用单因素方差分析法进行组间分析，设定显著性水平P =0.05。
2结果
2.1 FGFR1的表达及分布 大鼠晶状体上皮细胞中，FGFR1主要表达于胞质，呈非均一性的颗粒样阳性着色，并且大多数细胞都表达FGFR1（图1）；FGFR1在1mo龄组表达较强（IA =125619±13818），3mo龄组表达减弱 （IA =65681±5911），6mo龄组表达最弱（IA = 46146±3691），组间差异显著（P <0.05），提示FGFR1在大鼠晶状体上皮细胞中的表达随年龄的增长而减弱（图2）。
2.2 RT-PCR结果 PCR产物凝胶电泳结果显示，每组样本可扩增出两个目的条带，一条为317bp的FGFR1，一条为392bp的GAPDH（图3）；GAPDH在3组样本中表达稳定，无明显差异（P >0.05），FGFR1在1mo龄组表达最强，在3mo龄组表达明显减弱，在6mo龄组表达进一步减弱；计算吸光度比值（FGFR1/GAPDH）作为FGFR1 mRNA的表达量，1mo龄组为1.32±0.41，3mo龄组为1.01±0.33，6mo龄组为0.68±0.20，经检验，组间差异显著（P <0.05），提示FGFR1在大鼠晶状体上皮细胞中mRNA的表达随年龄的增长而减弱（图4）。
3 讨论
FGFs是一族细胞分裂促进因子，主要包括酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），bFGF的生物活性是aFGF的10~100倍，是最重要的FGF，二者作用于相同的受体，是促进细胞生长、分化、增殖的重要因子。FGFR1是FGF的高亲和性受体[1]，FGFs通过旁分泌和自分泌的方式，与晶状体上皮细胞中FGFR1结合，通过酪氨酸蛋白激酶途径，对晶状体上皮细胞增殖、移行与分化起调控作用，发挥其生物学效应；有关FGFs，特别是bFGF对晶状体上皮细胞增殖与分化的影响，已有较多的研究，一般认为，不同种属来源的bFGF，其氨基酸组成序列差异甚微，且不同种属动物间房水中bFGF浓度差别不大[1]，组织损伤、白内障手术等可引起房水中bFGF浓度的增加[2,3]，bFGF促进晶状体上皮细胞的增殖，并在一定范围内呈剂量依赖性[4,5]，因而在后发性白内障形成机制中有重要作用，bFGF对晶状体上皮细胞增殖、分化作用与年龄呈负相关[6]，可能与FGFR1随年龄增加而减少有关[7,8]。
研究bFGF对晶状体上皮增殖与分化的影响时，应考虑到其相应受体表达的情况，有关正常晶状体上皮细胞FGF受体表达与年龄间的关系未见报道，我们采用的1~6mo大鼠，大致反应了大鼠由幼年到成年的变化，结果提示，大鼠由幼年至成年过程中，晶状体上皮细胞中FGFR1在转录及蛋白水平的表达逐渐降低，与Blanquet等[8]结论相似，说明晶状体发育成熟后，其上皮细胞增殖活动逐渐减弱，进入一个生长稳定期；有人[9]研究了不同年龄白内障晶状体上皮细胞中FGFR1的表达情况，也发现与年龄呈负相关；这些研究结果可以解释bFGF促增殖、分化作用随年龄增加而降低的现象[10,11]。
图 2 FGFR1在大鼠晶状体上皮细胞中的表达
图 3 FGFR1 PCR产物电泳结果
图 4 FGFR1 mRNA在大鼠晶状体上皮细胞中表达
白内障手术后，炎症及组织损伤使房水中bFGF含量增加，从而促进晶状体上皮细胞增殖、移行，并在后囊膜处堆积，形成后发性白内障。我们发现，幼年晶状体上皮细胞比成年的晶状体上皮细胞表达更多的FGF受体，提示对FGF更敏感，也说明儿童白内障术后更容易发生后发性白内障。糖皮质激素在术前及术后的使用，可能对后发性白内障形成有一定抑制作用，体外研究发现，同时应用激素与bFGF较单独应用bFGF，后囊膜混浊程度较轻[12,13]，说明激素对后发性白内障有抑制作用，Wallentin等[14]发现，白内障手术后，房水中bFGF浓度并没有因为应用激素而有明显变化，提示激素很有可能是通过抑制FGF受体的表达，从而达到抑制细胞增殖的作用。因此，研究糖皮质激素是否影响晶状体上皮细胞FGF受体的表达，是我们下一步需要做的工作。
【】
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