灯盏细辛抑制外源性 VEGF诱导的大鼠视网膜血管病变TGFβ1的表达
【摘要】 目的：探讨灯盏细辛(EBHM)对外源性 VEGF诱导的大鼠视网膜血管病变眼玻璃体腔TGFβ1和视网膜TGFβ1 mRNA表达的影响。方法：大鼠48只随机分为rrVEGF164,rrVEGF164 + EBHM, rrVEGF164+NS和正常对照4组。rrVEGF164+EBHM组每天60g/L 的灯盏细辛浸膏ip。分别于不同时间收集玻璃体液后采用ELISA检测 TGFβ1的浓度,并提取视网膜总的RNA后行RT-PCR检测TGFβ1 mRNA的表达。结果：在2wk或6wk时VEGF、VEGF+NS和VEGF+EBHM 组实验眼玻璃体内TGFβ1的浓度均高于正常对照组 （P <0.05）。VEGF+EBHM组低于VEGF组和VEGF+NS组（P <0.05）。各组TGFβ1mRNA/GAPDHmRNA的差异与玻璃体内的TGFβ1浓度变化一致。结论：rrVEGF164作用大鼠玻璃体内TGFβ1 浓度升高，视网膜TGFβ1 mRNA表达增强。灯盏细辛能部分抑制rrVEGF164诱导的大鼠视网膜血管病变玻璃体内TGFβ1浓度的升高和视网膜TGFβ1 mRNA表达的增强。
【关键词】 重组大鼠血管内皮生长因子 灯盏细辛 转化生长因子β1
Inhibition of EBHM on the expression of TGFβ1 in the retinal vasculopathy induced by exogenous VEGF in rats
Abstract AIM: To investigate the effects of EBHM on TGFβ1 in the vitreous and the expression of retinal TGFβ1 mRNA in the retinal vasculopathy induced by exogenous VEGF in rats. METHODS: Forty-eight rats were randomly divided into four groups: rrVEGF164, rrVEGF164+NS, rrVEGF164+EBHM and normal group. Rats in rrVEGF164+EBHM group were administrated intraperitoneally with 60g/L EBHM solution. Captured vitreous humor and total extracted retinal RNA were analyzed by ELISA for the concentration of TGFβ1 and RT-PCR for expression of TGFβ1 mRNA in different time respectively. RESULTS: Two or six weeks after the first of intravitreal rrVEGF164 injection, the concentration of TGFβ1 in the vitreous of experiment eyes among rrVEGF164, rrVEGF164+NS and rrVEGF164+EBHM group were higher than that of in normal group(P <0.05). The concentration of TGFβ1 in the vitreous of experiment eyes in rrVEGF164+EBHM group were lower than that of in rrVEGF164 and rrVEGF164+NS group (P <0.05).The differences in the ratio of TGFβ1 mRNA and GAPDHmRNA in every group were as same as that in the change of concentration of TGFβ1 in the vitreous.· CONCLUSION: TGFβ1 in the vitreous and expression of TGFβ1mRNA increased after intravitreal rrVEGF164 injection.EBHM has partial inhibitory influncence on the elevated concentration of TGFβ1in the vitreous and expression of TGFβ1mRNA in the retinal vasculopathy induced by exogenous rrVEGF164 in rats.
· KEYWORDS: rrVEGF164; EBHM; TGFβ1
0引言
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是目前已知最重要的血管新生促进因子，而转化生长因子β1 (transforming growth factorβ1,TGFβ1)的生理作用比较复杂，对于不同的靶细胞以及同一靶细胞的不同状态下，显示出不同作用。体外实验表明TGFβ1能增加细胞VEGF的分泌，而VEGF是否对TGFβ1具有何种作用，未见报道。为了阐明外源性VEGF对TGFβ1的相互作用，我们检测了外源性VEGF诱导的大鼠视网膜血管病变模型眼TGFβ1的表达情况，并研究了灯盏细辛[erigeron breviscapus(vant.)Hand-mazz，EBHM]对其表达的影响。
1材料和方法
1.1材料 Sprague-Daweley大鼠(中南大学湘雅二动物实验中心提供, 雌雄各半，体质量200～240g) 48只随机分为4组(每组12只): 正常对照组,不作眼内注射。VEGF组实验眼(右眼)玻璃体腔注射浓度为100mg/L rrVEGF164 4μL，隔天1次，共4次。自身对照眼(左眼)，注射等量的0.1mol/L PBS，注射频率与实验眼一致。VEGF+EBHM组于玻璃体腔注射当天开始，按150mg/kg体重，60g/L的灯盏细辛 (EBHM) 浸膏 ip，每天1次。VEGF+NS组于玻璃体腔注射当天开始，按EBHM计量，生理盐水ip，每天1次。VEGF+EBHM，VEGF+NS组实验眼和自身对照眼玻璃体腔注射与VEGF组相同。每组分别于2wk和6wk在散瞳后直接眼底镜观察眼底后各处死6只。酶联免疫检测仪（芬兰Labsystems公司）, 基因扩增仪（PE9600，美国PE公司） ,TGFβ1ELISA试剂盒（上海森雄试剂公司）,扩增TGFβ1cDNA引物（上海生物工程有限公司）正义链：5′-GCTAATGGTGGACCGCAAC-3′ ,反义链：5′-GCAGTGAGCACTGAAGCGA-3′。扩增内对照GAPDHcDNA引物（上海生物工程有限公司）正义链：5′-GTGCTGAGTATGTCGTGGA-3′，反义链：5′-CACAGTCTTCTGAGTGGCA-3′。RT-PCR试剂盒（Promega 公司，美国），玻璃毛细管，重组大鼠血管内皮生长因子（rrVEGF164，Sigma公司）。
1.2方法 大鼠充分散瞳后，30g/L戊巴比妥钠溶液（1mL/kg）ip麻醉。结膜囊表面麻醉，眼科手术显微镜下用30#B-D针头于背侧角膜缘后1mm处刺穿眼球壁后立即出针，角膜缘行前房穿刺，消毒剪刀将自制玻璃体腔微量注射针针尖剪去，暴露开口。10μL加样移液器抽取rrVEGF164 或PBS 4μL注于消毒的点样纸上。自制玻璃体腔微量注射针立即吸取。沿预先穿刺好的针孔处以45o～50o的角度进入眼内并缓慢注射，停留约15s后拔针。术眼涂眼膏，术后3d 3g/L诺氟沙星滴眼液滴眼，每天2次。注射rrVEGF164或PBS前、后，出现玻璃体出血者不纳入实验对象。深度麻醉大鼠后摘除眼球，去除眼前节和玻璃体，吸取玻璃体液于离心管内，剥取视网膜于冻存管内。玻璃体液在制冷离心机4℃下3 000r／min离心20min，收取上清液，移于EP管内，-70℃冰箱保存。TGFβ1ELISA按试剂盒说明书进行。冻存管内视网膜立即放入液氮内，-70℃冰箱保存。Trizol提取视网膜组织总的RNA,RT-PCR反应,取PCR产物4μL，在10g/L的琼酯糖凝胶上电泳，100V 45min，在紫外灯下观察并照相。应用ImageMasterVDS 3.0软件分析系统，对RT-PCR琼酯糖凝胶结果成像并行电泳条带光密度测定。
统计学处理: 资料正态检验,方差齐性检验后, 数据均用均数±标准差表示，不同组间用方差分析,采用SPSS for Windows 11.5统计软件处理，P <0.05认为统计学差异有显著性。
2结果
2.1玻璃体液TGFβ1含量 2wk时TGFβ1 VEGF、VEGF +NS 和VEGF+EBHM组右眼玻璃体内TGFβ1的浓度均高于正常对照组（P <0.05）。VEGF+EBHM组低于VEGF和VEGF+NS组（P <0.05）。6wk时上述各组右眼玻璃体内TGFβ1的浓度无明显变化（表1）。
2.2视网膜TGFβ1mRNA表达 紫外灯下观察到28S、18S、5S条带，比例适当。经紫外分光光度仪测定各样本纯度A 260/A 280介于1.8～2.0之间。所有实验组和对照组均检测到TGFβ1基因和内参照GAPDH基因的表达。400bp附近条带为TGFβ1 DNA（340bp），未出现明显杂带。在300bp附近有一条带即为内参照GAPDH DNA 条带（298bp），表明扩增产物具有较高的特异性（图 1）。所有组双眼均有TGFβ1mRNA表达。正常组有弱表达，VEGF注射后TGFβ1mRNA表达增强，EBHM后TGFβ1mRNA表达略有增强。2wk时, VEGF组、VEGF+NS组和VEGF+EBHM组右眼视网膜TGFβ1mRNA/GAPDHmRNA比值均高于正常对照组（P <0.05）。VEGF+EBHM组低于VEGF组和VEGF+NS组（P <0.05）。6wk时上述各组右眼视网膜TGFβ1mRNA/GAPDHmRNA比值无明显变化（表2）。
图 1 注射rrVEGF164眼视网膜TGFβ1mRNA的表达 1.正常对照；2.VEGF 2wk；3.VEGF+EBHM 2wk；4.VEGF+EBHM 6wk;5.VEGF 6wk;6.VEGF+NS 2wk;7.VEGF+NS 6wk;8.DNA Ladder
3讨论
TGF-β1是TGF家族中研究最多的多肽之一,生物学作用比较复杂。对视网膜、脉络膜血管内皮细胞的离体、在体的作用，报道不一。Mandnota等[１]研究发现,TGF-β1降低牛微血管内皮细胞FLK-1 mRNA和蛋白质的表达。他们认为,TGF-β1是内皮细胞VEGF/FLK-1信号转导途径的重要调节因子。视网膜广泛光凝后，视网膜色素上皮细胞表达TGF-β1持续升高，在后期可能存在抑制细胞增生的作用[２]。以往研究注重于TGFβ1对VEGF的作用，本研究显示,正常大鼠玻璃体腔存在微量的TGFβ1，实验眼注射rrVEGF164后玻璃体TGFβ1升高。玻璃体TGFβ1来源于RPE细胞、视网膜血管内皮细胞、虹膜色素上皮细胞、小梁组织细胞、胶质细胞等多种细胞。为了排除rrVEGF164所导致的玻璃体TGFβ1浓度变化的非特异性。我们进一步采用RT-PCR的方法检测了视网膜TGFβ1mRNA表达的变化。实验结果显示,实验眼注射rrVEGF164后，视网膜TGFβ1mRNA表达增强。证明rrVEGF164对TGFβ1具有正向调控作用。我们推测，在VEGF诱导大鼠视网膜血管病变的早期阶段（2wk），一方面，VEGF直接刺激视网膜TGFβ1的生成和分泌。另一方面，视网膜血管内皮细胞肥大，毛细血管缩窄[３]，微循环发生变化，血管通透性发生改变。血浆活性物质刺激视网膜细胞分泌TGFβ1增多。在较晚期阶段（6wk），VEGF的直接作用已经消失。但是根据我们前面的研究，组织学显示有毛细血管增生[３]，从侧面证明视网膜存在缺氧，OPS总波幅的降低[３]也证实了这一点。缺氧或早期阶段已启动的内源性因素正向作用，导致TGFβ1的升高。我们认为在这种病变的不同阶段，VEGF对TGFβ1的直接或间接作用各有侧重。可能VEGF的直接作用主要表现在早期，而其间接作用则相反，因而导致TGFβ1在2wk和6wk的玻璃体浓度没有差别。
EBHM又名灯盏花，生物活性成分有50余种[4,5]。我们使用的EBHM浸膏含有多种黄酮、灯盏乙素等活性物质。在玻璃体腔注射rrVEGF164当天开始，60g/L灯盏细辛浸膏ip后，玻璃体内TGFβ1的浓度与视网膜TGFβ1mRNA的表达量比模型组明显降低，但较正常对照组高，说明EBHM 能部分抑制VEGF对TGFβ1的正向调控作用。TGFβ1的这种波动，结合EBHM对VEGF诱导大鼠视网膜血管病变抑制作用的组织学特征[1]，我们推测，EBHM改善了视网膜微循环后，外源性VEGF的直接作用及缺氧所启动的内源性VEGF的作用被部分阻断，视网膜内屏障得到保护，使血浆抗纤溶蛋白酶的活性变化，从而部分抑制VEGF对TGFβ1正向调控作用。VEGF发挥作用主要是通过PKC途径，而EBHM的提取物灯盏花素（野黄苓甙元）能非竟争性地抑制组织的PKC活性[6]。因此我们推测EBHM主要通过阻断外源性或内源性VEGF对TGFβ1的正向调控作用，从而部分抑制TGFβ1的表达。
【文献】
１ Mandriota SJ, Menoccd PA, Pepper MS.Transforming growth factor beta 1 down-regulates vascular endothelial growth factore receptor 2/fik-1 expression in vascular endothelial cells.J Biol Chem ,1996;271(19):11500-11505
２ Yamamoto C, Ogata N, Yi X, Takahasi K,Miyashiro M,Yamada H,Uyama M, Mastuzaki K. Immunolocalization of transforming growth factor beta during wound repair in rat retina after laser photocoagulation.Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol,1998;236(1):41-46
３ Wang QC, Tang LS.Retinal vasculopathy induced by exogenous VEGF in rats. Int J Ophthalmol (Guoji Yanke Zazhi) ,2006;6(2):369-372
4张卫东,陈万生,孔德云,李惠庭,王永红,杨根金.中药灯盏细辛化学成分的研究（Ⅱ）.第二军医大学学报,2000;21(10):914-916
5 Shi JM, Jiang YQ, Liu XY. Neuroprotective effect of Erigeron Breviscapus (vant) Hand-Mazz on NMDA-induced retinal neuron injury in the rats. Int J Ophthalmol (Guoji Yanke Zazhi) ,2005;5(5):859-863
6徐光,张礼萍,沈慧芬.野黄苓甙元及其类似物对PKC的抑制作用.上海医科大学学报，1993;20(3):189-191
