培养人视网膜色素上皮细胞脂褐素形成对胞内钙离子和细胞活力的影响
作者：张乐 惠延年 马丽娜 王静波 刘晓娟 王雨生
【摘要】 目的：观察培养人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial，RPE)细胞在吞噬牛光感受器外节(photoreceptor outer segments，POS)膜盘形成脂褐素的过程中，胞内钙离子浓度及细胞活力的变化。 方法：将培养人RPE细胞与制备的2×1010 /L牛POS共培养，在形成脂褐素过程中，用钙荧光指示剂Fluo-3/AM和激光扫描共聚焦显微镜 (laser scanning confocal microscope，LSCM) 观察培养0.5，1，2，4和8d时间点胞内钙离子的变化；用MTT比色法观察培养0.5，1，2，4和8d的细胞活力。结果：对照组RPE细胞内钙离子荧光强度为165.4±29.9U，而与POS培养的细胞内钙离子荧光强度在0.5d达到高峰值777.3±63.9(P <0.01), 4d下降至316.9±36.1U (P <0.01)，但至8d仍维持在较高值334.1±30.6U (P <0.01)。细胞内脂褐素自发荧光平均强度在培养8d达到350.2±26.5U (P <0.01)，而对照组为105.5±15.4U。MTT法显示共培养0.5，1，2，4和8d细胞相对增殖率分别为4.9%，84.4%，54.7%，21.1%和11.2%，细胞增殖活力在共培养1d达到最大值，之后下降。结论：在培养人RPE细胞和牛POS共培养形成脂褐素过程中，钙离子大量内流，细胞增殖活力增加。
【关键词】 脂褐素 视网膜色素上皮细胞 钙离子 活力 MTT 光感受器外节
Effects of the formation of lipofuscin on the calcium and the activity of cultured human retinal pigment epithelial cells
Abstract AIM: To observe the calcium flux and the activity of the cultured human retinal pigment epithelial (RPE) cells in the formation of lipofuscin which results from RPE phagocytizing the membranous discs shed by bovine photoreceptor outer segments (POS). METHODS: The cultured human RPE cells were fed with 2×1010 /L bovine POS. During the formation of the lipofuscin, the cells were analyzed with the fluoresence Ca2+ dye Fluo-3/AM and a laser scanning confocal microscope (LSCM). The activity of cells was measured with tetrazolium salt (MTT) assay for 12 hours, 1, 2, 4 and 8 days.RESULTS: Calcium fluorescence intensity (CFI) of normal RPE cells was 165.4±29.9U. But in cells were fed with POS, it reached the peak with 777.3±63.9U (P <0.01) for 12 hours and decreased to 316.9±36.1U(P <0.01) for 4 days, then maintained a high level of 334.1±30.6U for 8 days. The mean autofluoresence intensity of the lipofuscin in RPE cells was 350.2±26.5U (P <0.01) for 8 d compared to 105.5±15.4U in controls. MTT assay showed that the proliferation rate of the cells fed with POS were 4.9%, 84.4%, 54.7%, 21.1% and 11.2% for 12 hours, 1, 2, 4 and 8 days, respectively. The activity of RPE cells showed its highest level for 1 day and then declined. CONCLUSION: In the formation of the lipofuscin when RPE phagocytizing bovine POS, calcium influx to RPE cells may play an important role in the generation and accumulation of lipofuscin，which may stimulate the cell activity.
· KEYWORDS: lipofuscin; retinal pigment epithelial cells; calcium; MTT; photoreceptor outer segments
Zhang L, Hui YN, Ma LN, Wang JB, Liu XJ, Wang YS. Effects of the formation of lipofuscin on the calcium and the activity of cultured human retinal pigment epithelial cells. Int J Ophthalmol (Guoji Yanke Zazhi) , 2007;7(2):368-372
0引言
RPE细胞层为视网膜结构的最外层，与光感受器外节相邻。RPE细胞每天吞噬光感受器细胞外节脱落的膜盘，残留物积聚即可形成脂褐素[1]。而脂褐素在细胞内的长期堆积则可以导致细胞结构和功能的改变，进而引起一系列相关疾病的发生，如年龄相关性黄斑变性及Stargardt病等[2]。脂褐素可产生自发荧光，通过激光共聚焦扫描显微镜检测其荧光强度可以间接分析其浓度变化。钙离子是细胞内重要的第二信使，细胞内许多重要的生理代谢活动及病理改变都与细胞内钙离子浓度有关。细胞内钙离子的轻度升高可以刺激细胞增生，活力增强[3]，浓度过高即钙超载，则可以诱发细胞损伤及凋亡[4, 5]。荧光探针技术和激光共聚焦扫描显微镜技术为我们提供了观察活细胞内钙离子变化情况的可能。我们通过RPE细胞与牛POS共培养，使RPE细胞吞噬POS脱落的膜盘，从而产生脂褐素，以模拟人RPE细胞内脂褐素的形成及蓄积过程[6]。在此过程中观察胞内钙离子和细胞活力的变化，探讨人RPE细胞内脂褐素的形成对细胞内钙离子和细胞活力的影响。
1材料和方法
1.1材料 第2代培养的人RPE细胞由第四军医大学王静波博士惠赠。将RPE细胞培养在含100mL/L灭活新生牛血清、100kU/L青霉素和100g/L链霉素的完全DMEM培养基中，于37℃，50mL/L CO2的培养箱中常规培养。每3d换1次培养液。2.5g/L胰蛋白酶消化传代，选取第3～6代细胞用于实验。POS参照Hall[7]的方法制备：取新鲜牛眼球，无菌处理后取出视网膜，并将其移入D-Hanks液配制的2.5g/L胰蛋白酶中,在冰上用磁力搅拌器搅拌消化15min,消化后的溶液于0℃ 静置10min,取上清液，3 000r/min离心10min，去上清后用D-Hanks液离心洗涤2次。将收集到的POS分散于培养液中，计数调整为2×1010/L。并用倒置显微镜和透射电镜进行鉴定。用2.5g/L胰蛋白酶消化近铺满的第3～6代培养人RPE细胞。(1)调整细胞密度为5×105/L，接种于内含9mm×9mm盖玻片的24孔培养板中，每孔培养液体积为1mL，设置RPE细胞对照孔；(2)调整细胞密度为10×103/L，接种于96孔培养板中，每孔培养液体积为200μL，设置RPE细胞对照组和空白对照孔。在37℃、含50mL/L CO2空气中培养24h贴壁生长后，根据分组，在不同时间点换以含有浓度为2×1010/L POS的培养液。每2d换液1次，常规培养0.5，1，2，4和8d进行测定。
1.2方法
1.2.1 LSCM检测细胞内钙离子及脂褐素荧光强度 将上述24孔板生长的细胞均分为两部分，随机取一部分负载检测细胞内钙离子浓度：用D-Hanks液洗涤细胞2次，加入D-Hanks液配制的终浓度为10μmol/L的Fluo-3/AM (Biotium公司)负载，在37℃，含50mL/L CO2空气中孵育30min，荧光染色后，每孔再用D-Hanks液洗涤3次，尽量洗去未负载的探针，取出孔板中盖玻片置于Olympus FV1000激光扫描共聚焦显微镜 (LSCM) 载物台上立即检测荧光。记录背景荧光为对照值。荧光激发波长为488nm，收集波长为FV1000型激光扫描共聚焦显微镜软件特有的Fluo-3/AM 的收集波长。另一部分用于检测细胞内脂褐素自发荧光强度：用D-Hanks液洗涤细胞2次，即取出孔板中盖玻片置于LSCM载物台上立即检测，记录背景荧光为对照值，用488nm波长荧光激发，收集波长为530nm左右，可以采集到黄绿色细胞荧光图像。
1.2.2 MTT法测定细胞活力 绘制正常培养液培养及含有POS的培养液培养的人RPE细胞生长曲线。取上述于96孔板生长的细胞，每孔加入5g/L的MTT (Sigma公司) 溶液20μL，在37℃、含50mL/L CO2空气培养箱中孵育4h，吸出上清液，加入二甲基亚砜 (DMSO) 150μL，在摇床上振荡10min以充分溶解甲臜，再于酶标仪上用490nm波长检测读取光吸收度 (A 值)，根据每组光吸收度平均值以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线[8]，并细胞增殖率。
统计学处理：以上实验均重复3次，统计学处理采用SPSS11.5统计软件，采用t 检验进行统计学分析各组之间的差别，数据以 表示，P < 0.01有统计学意义。
2结果
倒置显微镜下观察POS呈大小均一的棒状分散在培养液中 (图1A)；透射显微镜下可见POS双层膜盘结构，与外节长轴垂直或平行排列 (图1B)。
图 1 POS形态 A倒置显微镜×200；B透射电子显微镜× 15 000
2.1激光共聚焦扫描显微镜分析 Fluo-3/AM负载后RPE细胞内钙离子荧光着色很强，遍布整个细胞，尤以细胞核为著。对照组培养人RPE细胞钙离子平均荧光强度绝对值为165.4± 29.9U，和牛POS共培养后钙离子荧光强度显著增强，0.5d达到高峰，平均荧光强度绝对值为777.3±63.9U (P <0.01)，以后下降，1，2，4和8d平均荧光强度绝对值分别为504.6±40.8U (P <0.01)、356.6±28.6U (P <0.01)、316.9±36.1U (P <0.01)和334.1±30.6U (P <0.01)，后几个时间点测量值维持在一定高度 (图2，3)。在480nm蓝光激发下，RPE细胞可见胞质内脂褐素自发大小不均一颗粒状黄绿色荧光。未加处理组平均荧光强度绝对值为105.5±15.4U，而0.5，1，2，4和8d的平均荧光强度绝对值分别为115.7±23.0U (P >0.05)、137.4±35.1U(P >0.05)，142.7±36.5U (P >0.05)，315.9±32.7U (P <0.01)和350.2±26.5U (P < 0.01)，呈逐步上升趋势（图3，4）。
2.2细胞增殖率 培养人RPE细胞和牛POS共培养，共培养0.5d光吸收值共培养组与对照组 (t ＝1.859，P >0.05) 无显著性差异；1，2，4和8d组间光吸收值均有显著性差异 (t＝24.283，14.879，5.716，3.559；P <0.01)。0.5，1，2，4和8d细胞相对增殖率分别为4.9%，84.4%，54.7%，21.1% 和11.2%。细胞增殖率于1d达到最大值，后下降（MTT法，图5）。
3讨论
脂褐素又有“老年性色素”和“消耗性色素”之称。RPE细胞每天吞噬POS末端不断脱落的膜盘，其残留物积聚形成脂褐素，进而影响细胞的组织结构和生理功能的改变，促使细胞衰老乃至死亡。光感受器外节富含长链多不饱和脂肪酸，易受氧化损伤。在视网膜缺血缺氧、光照损伤等病理情况下，可以造成视网膜光感受器外节的损伤，大量膜盘脱落[9,10]。从而使RPE吞噬负担加重，大量形成脂褐素，则可能会造成RPE过度损伤及诱导细胞凋亡。以往报道，RPE中的脂褐素，很大一部分来源于氧化损伤的POS[11]。钙离子是细胞内各种生理活动重要的第二信使，也是细胞损伤重要的介导因素。正常静息状态下细胞内外Ca2+ 存在着约104倍左右的浓度差，细胞内Ca2+约为10-7~10-8 mol/L，而细胞外Ca2+ 浓度高达10-3~10-4 mol/L。维持胞内钙离子低浓度稳态对于保持细胞的正常功能具有很重要的作用。细胞内游离Ca2+ 浓度的升高，可以活化许多酶，耗竭ATP，产生自由基导致细胞许多成分的破坏，诱发细胞凋亡[12]。因而游离Ca2+ 平衡稳态的破坏与细胞损伤及衰老密切相关。在RPE吞噬POS形成脂褐素衰老过程中，钙离子是否担当了一定的角色？
Fluo-3/AM荧光探针是新一代的长波钙离子荧光探针，敏感度及特异性高，用其负载胞内钙离子可以高效检测细胞内Ca2+ 的变化[13]。本实验采用激光扫描共聚焦显微镜测量Fluo-3/AM负载的钙离子荧光值，为胞内Ca2+ 荧光强度总和，代表细胞内总的Ca2+ 浓度。结果表明，培养人的RPE细胞和牛POS共培养后胞内Ca2+ 荧光强度显著增强，表示在此过程中胞内Ca2+ 浓度显著增高，其来源主要为胞外Ca2+ 的大量内流。本实验结果显示，培养人RPE细胞和牛POS共培养，脂褐素浓度随培养天数而增加，而胞内钙离子浓度的变化与脂褐素的变化并不呈平行关系。在共培养初期 (0.5d)，胞内钙离子荧光值显著升高，达到高峰777.3±63.89U (P <0.01)，因而我们推测在共培养产生脂褐素早期，RPE细胞接触识别并吞噬POS脱落膜盘阶段，钙离子内流可能起到了信号介导作用；而后随着培养天数的延长，胞内钙离子荧光值有所下降，但在一定时期 (8d) 内仍维持在较高值334.1±30.6U，与对照组相比仍有统计学显著性差异 (P<0.01)。钙离子荧光值有所下降可能是由于细胞内自有的缓冲作用，但其仍维持在一定高度表示胞内钙离子在脂褐素的产生及蓄积过程中可能仍在发挥作用。
MTT比色法分析结果表示，在RPE和POS共培养的1d，细胞相对增殖率达到84.4%，细胞活力显著增强，但是随着RPE与POS共培养的天数的增加，细胞增殖率又有所下降。国外文献报道，细胞内Ca2+ 浓度的升高可以促进细胞的增殖[3]。本研究中1d细胞增殖率的升高考虑与RPE细胞脂褐素形成过程中细胞内Ca2+ 浓度的升高有关，2～8d细胞增殖活力的下降考虑为胞内钙超载及大量脂褐素的积聚造成了细胞的损伤，活力下降，甚至发生凋亡。
在培养人RPE细胞和牛POS共培养形成脂褐素过程中，钙离子大量内流，其变化可能在脂褐素产生及蓄积过程中起到重要的作用，并在一定程度上影响细胞的增殖活力。过度的钙离子内流可造成胞内钙超载，可能是脂褐素蓄积损伤细胞结构与功能的原因之一。阻止钙离子的过度内流，是否可以缓和脂褐素的生成及减少其对细胞的损伤，从而预防老年性黄斑变性等由于脂褐素过度沉积所引起的病变，尚需进一步探讨。
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