反义寡核苷酸抑制大鼠损伤视神经Nogo-A mRNA的表达

          作者：袁容娣　叶剑　彭锡嘉　刘少章

【摘要】  　　目的：观察反义寡核苷酸对损伤视神经Nogo-A的影响。方法：实验分为对照组、随机序列组、和2，5，10μmol/L 3种Nogo-A反义寡核苷酸浓度组。大鼠视神经钳夹伤后，采用逆转录-聚合酶链反应法（RT-PCR），半定量分析反义寡核苷酸对损伤视神经Nogo-A mRNA表达量的变化。 结果：反义寡核苷酸均显著降低Nogo-A mRNA的表达 （P <0.01），随机序列对Nogo-A mRNA的表达无影响(P >0.05)。结论：反义寡核苷酸对视神经损伤后Nogo-A mRNA表达有抑制作用。

【关键词】  反义寡核苷酸　Nogo-A　视神经　创伤　RT-PCR

　　Effects of antisense oligodeoxynucleotides on Nogo-A mRNA expression in injured optic nerves

       AbstractAIM: To observe the effects of antisense oligodeoxynucleotides (ASODN) on Nogo-A mRNA expression in injured optic nerves. METHODS: A total of 30 rats were divided into five groups: control group, random sequence group and test groups (2μmol/L, 5μmol/L and 10μmol/L Nogo-A antisense oligodeoxynucleotides). reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) method was used in the detection of the levels of Nogo-A mRNA in injured optic nerves. RESULTS: The result of RT-PCR showed that Nogo-A antisense oligodeoxynucleotides could significantly inhibit the expresson of Nogo-A mRNA (P<0.01), random sequence antisense oligodeoxynucleotides had no noticeable effect on Nogo-A mRNA. CONCLUSION: Nogo-A antisense oligodeoxynucleotides can inhibit the expresson of Nogo-A mRNA in injured optic nerves.

    · KEYWORDS: antisense oligodeoxynucleotides; Nogo-A; optic nerve; injury; reverse transcriptase-polymerase chain reaction

　　0引言

    视神经损伤是临床常见的眼外伤，迄今仍缺乏有效的手段。研究证实，微环境中存在神经生长抑制因子是成年中枢神经再生能力低下的原因之一,中和或减少神经生长抑制因子可以促进成年哺乳动物RGCs轴突再生。Nogo-A是最具特征性的神经生长抑制因子。2000年美国、英国、瑞士的3个实验室[1-3] 同时报道Nogo基因成功克隆，它编码3种蛋白（Nogo-A,-B,-C）。Nogo-A具有最强的神经生长抑制作用，其抗体IN-1可以中和这种抑制作用。研究表明[4]，反义寡核苷酸对培养的视神经少突胶质细胞Nogo-A的表达具有抑制作用，我们通过在体实验研究反义寡核苷酸对损伤视神经Nogo-A表达的影响。

    1材料和方法

    1.1材料 8～10wk Wistar雄性大鼠30只，体质量200～250g，由第三军医大学大坪野战外科研究所实验动物中心提供，分为实验组、随机序列组及对照组，每组6只，3个实验组分别用2，5，10μmol/L 反义寡核苷酸10μL球后注射，对照组用注射用水10μL。硫代反义寡核苷酸序列为5-TGC TTT CGG TTG CTG AGG TA-3，浓度定为2μmol/L；同时设计一段随机序列，其序列为5-GCA GAC CAG CGC GGA GCT-3。经基因库检索，Nogo-A反义核酸片段仅与Nogo-A有同源性，而随机序列同所有基因均无同源性。由大连Takara公司进行全硫代修饰（高纯度级）。1.2方法 10g/L戊巴比妥钠0.8mL(30mg/kg)ip麻醉， 暴露视神经，在球后2mm处用动脉夹夹持视神经40s，致伤后按以上分组分别球后注射不同浓度的反义寡核苷酸或注射用水，隔24h给药1次，共2次。伤后3d，断颈处死大鼠，取伤侧视神经置于组织研磨器中研磨匀浆，-70℃冻存备用。采用Trizol试剂提取视神经总RNA。用DU-640型紫外分光光度计进行定量。引物合成:特异性引物设计，采用Premier 5.0软件设计，并经NCBI BLAS向基因库检索验证，与其它基因无高度同源性。由TaKaRa生物公司合成。Nogo-A引物序列，引物1： 5’-GTC CTG CTT GAA ACT GCT-3’；引物2：5’-CTT TCG GTT GCT GAG GTA-3’。 以(-actin作为内参照，引物序列如下，引物 1： 5’-ATC ATG TTT GAG ACC TTC A-3’；引物2：5’-CAT CTC TTG CTC GAA GTC-3’。RT-PCR反应：逆转录反应按照Promega公司M-MLV逆转录酶说明书进行操作。取各实验组反转录产物2μL，按以下条件进行扩增：（1）95°C 变性样品5min；（2）94°C变性30s；（3）50°C 退火40s；（4）72°C延伸60s；（5）返回反应（2），进行29个循环。最后一个循环72°C延伸10min。PCR反应产物10μL加载样缓冲液1μL，以1×TAE为电泳缓冲液，在20g/L 琼脂糖凝胶上电泳约1h(电压100V)。电泳完毕后，将琼脂糖凝胶经LabWorks4.0凝胶用图像分析系统仪进行图像分析。由该系统分析Nogo-A及(-actin的积分光密度值（IOD）。以各组Nogo-A/β-actin积分光密度的比值，作为Nogo-A的表达水平。

    统计学处理：应用单因素方差分析，比较各组Nogo-A表达的差异。采用SPSS10.0统计软件对计量资料进行统计分析（LSD-t 检验）。P <0.05时差异有统计学意义。

    2结果

    实验组（2，5，10μmol/L）与对照组、随机序列组比较，Nogo-A mRNA表达差异显著（P <0.01，图1，2），提示不同剂量2μmol/L反义寡核苷酸对视神经损伤后Nogo-A mRNA表达均有抑制作用。2μmol/L组与5，10μmol/L组比较相差非常显著（P <0.01），5μmol/L与10μmol/L组之间相差不显著（P >0.05）。随机序列组与对照组之间无显著差异 (P >0.05)。提示硫代随机序列对视神经损伤后Nogo-A mRNA的表达无明显影响。

    图1 Nogo-A ASODN对视神经Nogo-A mRNA表达的作用

    图2 ASODN对损伤视神经Nogo-A表达的影响 1.Control; 2.Nogo-A ASODN(2μmol/L); 3.Nogo-A ASODN(5μmol/L);4.Nogo-A ASODN(10μmol/L); 5.Random sequence(10μmol/L);M, Marker

    3讨论

    视神经损伤是常见的一类眼外伤，预后不良，约有40%～50%的患者失明。在颅脑损伤中，视神经损伤的发生率为0.3%～5.2%。传统的观点认为中枢神经受损后不能再生。然而，近年来许多研究证明在一定条件下，中枢神经可以再生。中枢神经系统髓磷脂是髓鞘的化学成分，是由成熟的少突胶质细胞的质膜生长形成的。1988年Schwab等分离大鼠CNS髓磷脂蛋白，获得两种对神经突生长具有强烈抑制作用的蛋白，分子质量分别为35kDa和250kDa[5,6]。遂提出神经突生长抑制因子（neurite growth inhibitor，NI）的概念。这2种蛋白被称为NI-35/NI250。其mAb IN-1抗体能和NI-35/NI250结合并可以选择性地抑制成熟少突胶质细胞及中枢神经系统白质对轴突再生的抑制作用，促进轴突再生[7-9]。如将产生IN-1抗体的杂交瘤细胞注入大鼠背侧额皮质，然后切断动物的皮质脊髓束，发现损伤部位有大量再生的轴突芽，2～3wk内可观察到长达7～11mm的轴突芽及轴突束，对照组虽然也有再生轴突芽，但其生长很少超过1mm[10]。

    2000年初，家成功地克隆了抑制神经再生基因——Nogo。它编码抑制性蛋白NI-35/250。Nogo基因编码长度为3 489bp，通过可变启动子和可变RNA剪接方式，转录的mRNA有3种。对应的蛋白分别称为Nogo-A，B和C。Nogo-A的全长序列对神经生长具有强烈的抑制作用。它是髓鞘源性的神经突生长抑制因子及单克隆抗体IN-1的抗原。IN-1抗体可以中和其抑制作用[7-9,11]Nogo基因的成功克隆，为从基因水平视神经损伤提供了可能。

    Nogo-A对中枢神经再生具有强烈的抑制作用。Nogo基因的发现，为我们从基因水平研究视神经损伤修复提供了一个新途径。反义技术是根据核酸杂交原理设计针对特定靶序列的反义核酸，从而抑制特定基因的表达，高度专一地阻断其靶基因的表达。反义寡核苷酸的优点在于：（1）反义寡核苷酸是遵照靶基因特异性设计合成，只有互补的碱基之间才能够结合。Saison等应用HARAS基因点突变区域的反义寡核苷酸能够选择性地抑制突变基因的表达，而正常基因不受影响。与其它抑制剂比较，这种方法特异性高。（2）反义寡核苷酸较容易合成。（3）导入途径适当，反义核酸有较高的局部反应。反义寡核苷酸可以与靶mRNA杂交，形成RNA/DNA双链，形成空间位阻，阻止翻译过程；形成的RNA/DNA双链可以激活RnaseH，将RNA链降解破坏；通过Hoog-steen碱基配对形式，在基因组的靶基因部位，形成三链结构，阻止靶基因复制或转录[12,13]。由于体内广泛存在的核酸酶，天然寡核苷酸极易被降解，硫代修饰后的寡核苷酸抗核酸酶的能力提高10倍之多。它具有良好的水溶性、稳定性并易于大量合成。为了提高ASODN的抗核酸酶能力，我们对Nogo-A反义寡核苷酸及随机序列均进行了全硫代修饰，大大降低了ASODN的降解。因此，我们应用硫代反义寡核苷酸，对视神经Nogo-A mRNA表达的调控进行了研究。结果表明，浓度为2μmol/L反义寡核苷酸对视神经损伤后Nogo-A mRNA表达有抑制作用；3个实验组之间比较，2μmol/L组与5，10μmol/L组比较相差非常显著（P <0.01），5μmol/L与10μmol/L组之间相差不显著（P >0.05），硫代随机序列对视神经损伤后Nogo-A mRNA的表达无明显影响。

    本研究表明，反义寡核苷酸对视神经损伤后Nogo-A mRNA表达有抑制作用，这可能为治疗视神经损伤提供了新的思路。

【】
  　 1 Chen MS, Huber AB, van der Haar Me, Frank M, Schnell L, Spillmann AA, Christ F, Schwab ME. Nogo-A is a myelin-associated neurite outgrowth inhibitor and an antigen for monoclonal antibody IN-1. Nature ,2000;403:434-439

2 Prinjha R,Moore SE,Christie G, Vinson M, Blake S, Morrow R, Michalovich D, Simmons DL, Walsh FS. Inhibitor of neurite outgrowth in humans. Nature ,2000;403:383-384

3 GrandPr T, Nakamura F, Vartanian T, Strittmatter SM. Identification of the Nogo inhibitor of axon regeneration as a Reticulon protein. Nature ,2000;403:439-444

4彭锡嘉,刘少章,叶剑，袁容娣.反义寡核苷酸对视神经少突胶质细胞Nogo-A mRNA表达调控的实验研究.眼科研究,2003;21(5):485-488

5 Rubin BP, Dusart I, Schwab ME. A monoclonal antibody (IN-1) which neutralizes neurite growth inhibitory proteins in the rat CNS recognizes antigens localized in CNS myelin. J Neurocytol ,1994;23:209-217

6 Brosamle C, Huber AB, Fiedler M, Skerra A, Schwab ME. Regeneration of lesioned corticospinal tract fibers in the adult rat induced by a recombinant, humanized IN-1 antibody fragment. J Neurosci ,2000;20:8061-8068

7 Fournier AE, GrandPre T, Strittmatter SM. Identification of a receptor mediating Nogo-66 inhibition of axonal regeneration. Nature ,2001;409:341-346

8 Huber AB, Schwab ME. Nogo-A, a potent inhibitor of neurite outgrowth and regeneration. Biol Chem ,2000; 381:407-419

9 Goldberg JL, Barres BA. Nogo in nerve regeneration. Nature ,2000;403:369-370

10 Schnell L, Schwab ME. Axonal regeneration in the rat spinal cord produced by an antibody against myelin-associated neurite growth inhibitors. Nature ,1990;343:269-272

11 Buffo A, Zagrebelsky M, Huber AB. Application of neutralizing antibodies against NI-35/250 myelin-associated neurite growth inhibitory proteins to the adult rat cerebellum induces sprouting of uninjured purkinje cell axons. J Neurosci , 2000;20:2275-2286

12 Wang S, Lee RJ, Cauchon D. Delivery of antisense oligodeoxyibonucleotides against the human epidermal growth factor receptor into cultured Kbcells with liposomes conjugated to folate via polyethyleneglycol. Proc Natl Acad Sci USA ,1995, 92: 3318-3322

13 Tari AM, Lopez-Berestein G. Cellular uptake of antisense oligonucleotides. Curr Opin Investig Drugs ,2001;2:1450-1453